1测定-- 食品中黄曲霉毒素B1测定.doc

1测定’ 食品中黄曲霉毒素B1测定 　　【摘 要】本文用酶联免疫吸附法测定了毛豆中黄曲霉毒素B1含量，比传统的薄层荧光限量法具有技术先进，灵敏度高、特异性强、精密度高、重复性好、测定速度快、成本低、污染少等优点。 【关键词】食品；黄曲霉毒素；测定 0 引言 黄曲霉毒素B1是一种高毒性、高致癌性的物质，除可引发肝癌外，也可引起其他部位如肾、胃、支气管、腺体和皮下组织的癌肿，是食品卫生部门常规的检测项目之一。之前的方法都不能更好的检测出粮食作物、饲料和发酵食品中黄曲霉毒素的含量，今用酶联免疫吸附法能更灵敏准确的检出。该法是把抗原抗体免疫反应和酶的高效催化作用原理有机地结合起来的一种新型检测技术，其主要依据有三点：第一，抗原（抗体）能结合到固相载体的表面并仍保持其免疫活性；第二，抗体（抗原）与酶结合所形成的结合物仍保持免疫活性和酶的活性；第三，结合物与相应的抗原（抗体）反应后，结合的酶仍能催化底物生成有色物质，而颜色的深浅可定量抗体（抗原）的含量。酶联免疫吸附分析法主要有三种测定方法：即间接法、抗体夹心法和竞争法。前两种主要用于测定抗体和大分子抗原，适用于临床诊断上；而竞争法是测定小分子抗原的方法，因而尤其适用于食品卫生分析，该法主要有四步：1）将人工抗原吸附于固相载体，温育后清洗；2）加入含有抗原的待测液和抗体，温育后洗涤；3）加入酶标抗体，温育后清洗；4）加酶底物，温育后显色，并进行检测和结果判断。 图1 黄曲霉毒素化学结构 1 实验部分 1.1 酶联免疫吸附法的原理 利用固相酶联免疫吸附原理，将AFB1特异性抗体包被与聚苯乙烯微量反应板的空穴中，再加入样品提取液（未加抗原）及酶标AFB1抗原（已知抗原），使两者与抗体之间进行免疫竞争及应，然后加酶底物显色，颜色的深浅取决于抗体和酶标AFB1抗原结合的量，即样品中AFB1多，则被抗体结合酶标AFB1抗原少，颜色浅，反之则深。用目测法和仪器法与AFB1标样比较来判断样品AFB1的含量。 1.2 试剂和仪器 1.2.1 试剂 1）AFB1酶联免疫试剂盒的组成 包被抗体的聚苯乙烯微量反应板24孔或48孔 A试剂：样品的稀释液；B试剂：AFB1的标准溶液；C试剂：酶标AFB1抗原； D试剂：酶标AFB1抗原稀释液；E试剂：浓缩洗涤液；F试剂：显色底物液a； G试剂：显色底物液b；H试剂：终止液。 2）测试盒中试剂的配制 C试剂中加入1.5mlD试剂，溶解，混匀，配成实验用酶标AFB1抗原溶液，冰箱中保存。E试剂中加入300ml蒸馏水配成实验用洗涤液。 1.2.2 仪器 小型粉碎机；分样筛：内孔径0.995mm；分析天平：感量0.01g；滤纸：快速定性滤纸；培养箱：（0-50℃）±1℃；冰箱：4-8℃；AFB1测定仪或酶标测定仪，含有波长450nm的滤光片。 1.3 实验步骤 1）取样：称取5.0g的样品（毛豆，已粉碎）于100ml具塞三角瓶中，准确加入25.0ml甲醇水（1+1）溶液，振摇15min，过滤，弃去1/4初滤液，收集试样滤液，为此为样品提取液。 2）试剂平衡：将测试盒于室温中放置15min以上，平衡至室温。 3）小孔编号：根据实验需要截取相应孔数放置反应板框架上。设零号孔为仪器调零孔，2-7号孔为AFB1标准对照孔，其余孔为样品孔。 4）洗涤：每孔加入250微升左右的洗涤液，洗涤液不得溢出，放置1min后，甩掉洗涤液，在吸水纸上排干，重复洗板一次。 5）反应组成：按下列步骤所示（见表1），依次加入配好的溶液及待测溶液。 第一步：1号孔加入50微升A试剂（样品稀释液），2―7号孔分别加入系列的B试剂（AFB1标准溶液：0，0.1，0.25，0.5，1，2ng/ml）50微升，其余8、9号孔加入相应的待测样液。 第二步：1号孔加入50微升D试剂（酶标抗原稀释液），其余各孔均加入50微升C试剂（酶标抗原溶液）。 第三步：轻轻的振摇，使各孔中的反应物混匀。 表1 反应物组成 6）反应：将反应板放入37℃恒温培养箱中孵育30min。 7）洗涤：取出反应板，用力甩掉反应液，拍干。每孔加入250微升洗涤液且不得溢出，放置2min后，甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板4次。 8）显色：每孔分别加入F试剂（显色底物液a）和G试剂（显色底物b）各50微升，摇匀，将反应板放入37℃恒温培养箱中显色15min。 9）终止与仪器测定：每孔分别加入H试剂（终止液）50微升，摇匀后用酶标测定仪在450nm波长处测定各孔的吸光度A值。 2 结果与讨论 测定