拟步甲部分种核基因18SrDNA序列和分子系统学探究.doc

拟步甲部分种核基因18SrDNA序列和分子系统学探究 　　摘 要：拟步甲（Tenebrionidae）是鞘翅目的一个较大的类群，全球已知12个亚科100多族1 500多属约25 000种，我国已知9亚科45族280余属近1 300种。实验利用18SrDNA基因片段序列对拟步甲科的部分种进行系统发育分析，并对靶序列进行排序、比较、分析，计算核苷酸组成、变异位点和DNA序列差异，构建了分子系统进化树（NJ，ME），确定各类群间的系统关系，验证了宏观形态分类学。 关键词：拟步甲科；核18SrDNA；DNA序列；分子系统学 中图分类号 S435.622 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）19-25-03 在依据外部形态分类鉴定及相关学者工作的基础上，以拟步甲科的部分种类为研究对象，利用PCR技术通过对拟步甲科部分种类核18SrDNA基因序列的研究，探讨拟步甲科不同族之间、不同种之间的DNA分子的差异，研究选择类群的分类地位和亲缘关系，为丰富拟步甲科的分子系统学研究，进一步完善拟步甲科的分类系统，揭示其系统发育和演化提供分子水平的依据。 1 材料与方法 1.1 材料 选用拟步甲6个族中的9种进行实验，所用的昆虫标本采自宁夏（中卫、贺兰山、固原、中宁等县市）。材料来源及代号具体如表1所示。 1.2 实验方法 1.2.1 基因组DNA的提取 采用SDS-蛋白酶消化法提取昆虫的DNA，该方法参考印红[1]、代金霞[2]、朴美花[3]、张大治[4]、张迎春[5]、田英芳[6]等的方法并加以改进。即从100%的无水酒精中取出样本，用灭菌过的小剪刀将其腿部剪开，取出其腿部肌肉，滤纸吸干，研磨，用SDS/蛋白酶K消化液消化5h左右。用常规的酚/氯仿抽提法（酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1）提取基因DNA，乙醇促沉淀后溶解在48μL无菌水中，置-20℃环境备用。 1.2.2 PCR扩增反应体系（48μL） PCR扩增反应体系48μL，含10×Buffer缓冲液5μL，25mmol/L MgCl2 4μL，双蒸水29.45μL，引物各3μL，Taq酶0.3μL，dNTP（10mmol/L）1.25μL，模板2μL。 1.2.3 PCR扩增反应条件 PCR扩增反应条件如下（每样品的扩增（PCR）体积为48μL）：预变性：94℃，8min；每一次循环包括：94℃变性30s，45～50℃退火1min，72℃延伸70s，72℃延伸10min。共35个循环。 1.2.4 琼脂糖凝胶电泳法 产物采用琼脂胶进行平板电泳，即称取琼脂糖和0.5倍TBE缓冲液倒入到三角锥瓶，微波炉高温加热到胶体透亮拿出，冷却，胶体中加入10mg/mL的EB储存液1.5～2.5μL。电泳孔向负极（缓冲液的液面离胶面约0.5mm），取已提取的DNA样品6μL点样，用2.5μL缓冲液（0.25%溴酚兰+40%蔗糖），在60～80V的电压下电泳，待溴酚蓝离正极胶端约1.4cm处停止，放于紫外检测仪下观察，结果有亮带，说明总DNA已存在，照相记录。 1.2.5 DNA序列数据的处理和分子系统树的构建 将实验测定的9种拟步甲的18SrDNA序列和从GenBank中查询到的7种拟步甲的同源序列用Clustal X1.83软件详细比对，加以人工校对。用MEGA4.0软件计算碱基组成、不同位点转换和颠换平均值、种间的遗传距离等。用MEGA软件的ME法和NJ法分别构建分子系统树研究拟步甲科的系统发育关系。在构建系统发生树时，以一种芫菁Meloe proscarabaeus作为外类群（表2），同时应用自引导分析（bootstrapping）估计系统树中节点的自引导值。 3 讨论 真核生物的染色体上编码核糖体小亚基RNA的基因称为18SrDNA，由于18SrRNA基因在蛋白质合成中具有重要的功能，因此其基因序列及二级结构高度保守，一般认为它比较适合于研究高级阶元的系统发育[3]。印红[1]用核糖体18SrDNA全序列构建了蝗总科分子系统树上锥头蝗科和瘤锥蝗科的种类聚在了一起。王瑛[7]对棉铃虫18S核糖体RNA基因的序列及其分子系统学进行了分析。 从密码子不同位点的核苷酸频率及C+G含量表发现，4种碱基的含量相差不大；这与拟步甲科线粒体16SrDNA基因序列含有较高比例的A和T，而G和C含量较少[9]明显不同。18SrDNA的碱基组成无偏异，认为本研究的系统发育结果受碱基组成偏异的影响甚微或不受影响。而且在所测序列中，C+G的平均含量为53.0%，略高于A+T的平均含量47.0%。这与Hendriks等的研究结果甲虫18SrDNA基因序列的G+C含量为52%相接近。本研究的转换和颠换比平均值为2.3，大于2.