第十章：色谱技术.ppt

第一节 色谱技术概述 1、色谱技术又称为层析技术,是一 种物理化学分析方法. 2、原理：当溶质在两相间(固定相和流动相)做相对移动时, 利用混合物中个物质在两相间分配系数的差别, 各物质在两相间进行多次分配 ,从而使各组分得到分离. 3、在色谱法中，表面积较大的固体或附着在固体上且不运动的液体，静止不动的一相称为固定相；自上而下运动的一相（一般是气体或液体）称为流动相 色谱原理示意图 气相色谱样品分离示意图 —固定相涂敷在玻璃或金属板上—薄层色谱 纸色谱和薄层色谱主要使用于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备 柱色谱是常用的色谱形式，适用于样品分析、分离 超临界流体色谱—流动相是在接近它的临界温度和压力下工作的液体 气相色谱测定样品时需要气化，大大限制了其在生化领域的应用，主要用于氨基酸、核酸、小分子糖类等小分子的分析鉴定 液相色谱是生物领域最常用的色谱形式，适于生物样品的分离、分析 ①吸附色谱：是以吸附剂为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而达到分离目的的一种色谱技术 ②分配色谱：是根据在一个有两相同时存在的溶剂系统中，不同物质的而达到分离目的的一种色谱技术分配系数不同 ③凝胶过滤色谱：是以具有网状结构的凝胶颗粒作为固定相，根据物质的分子大小进行分离的一种色谱技术 ④离子交换色谱：是以离子交换剂为固定相，根据物质的带电性质不同而进行分离的一种色谱技术 ⑤亲和色谱：是指利用生物分子间的特异性亲和力（如酶和其抑制剂、抗体和抗原、激素和受体），将某种生物分子作为配体连接在特定载体（如硅胶、多糖类等）上作为固定相，对能与该配体产生特异性相互作用的生物分子进行分离的一种色谱技术 二、基本概念 （一）概述 液相色谱主要通过目标组分或待分离物在两相间的分配能力或作用力不同而使目标组分得以分离，其中一相保持不动，称为固定相，而另一相移动，称为流动相 柱色谱 1. 色谱柱 色谱柱通常用玻璃柱。工业上大型色谱柱可以用金属制造。 柱的入口端应该有进料分步器，使进入柱内的流动相分布均匀。 有时也可在色谱柱顶端加一层多孔的尼龙圆片或保持一段缓冲液层。 柱的底部可以用玻璃棉，也可以用砂芯玻璃板或玻璃细孔板支持固定相。 设计柱长时需考虑下列几点： (3)柱越长，长度和内径比越大，就越难得到均匀的填装。大多数色谱柱的长度25cm左右。 吸附剂应有最大的比表面积和足够的吸附能力 对欲分离的不同物质应该有不同的可解吸能力 与洗脱剂、溶剂及样品组分不会发生化学反应 颗粒均匀 有适当强度，在操作过程中不会破裂。 2）洗脱剂的选择原则 所选的洗脱剂纯度合格 与样品和吸附剂不起化学反应 对样品的溶解度大 粘度小，容易流动 容易与洗脱的组分分开。 洗脱剂的选择 常用的洗脱剂有：饱和的碳氢化合物、醇、酚、酮、醚、卤代烷、有机酸等 极性大溶剂的洗脱能力大 上样时可用极性小的溶剂，使组分容易被吸附，然后用极性大的溶剂作洗脱剂，使组分容易从吸附柱中洗出 先用极性小的溶剂洗脱，后用极性大的溶剂洗脱，可实现不同目标物分组洗脱 下列三个化合物用硅胶吸附色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯（95：5）洗脱，判断三者流出色谱柱先后顺序。 ?  A B C 由先到后： C→B→A 干法装柱 在柱下端加少许棉花或玻璃棉，再轻轻地撒上一层5mm厚的干净砂粒，或放置大小合适的玻璃砂芯； 打开下口后，将吸附剂经漏斗缓缓加入柱中，同时轻轻敲动色谱柱，使吸附剂松紧一致； 最后，将色谱柱用最初洗脱剂小心沿壁加入，至刚好覆盖吸附剂顶端平面，关紧下口活塞。 ②湿法装柱 先在吸附剂中加入合适量的色谱最初用洗脱剂调成稀糊状 把放好棉花、沙子或合适大小的玻璃砂芯的色谱柱下口打开，然后徐徐将制好的糊浆灌入柱子。 让吸附剂自然下沉。当洗脱剂刚好覆盖吸附剂平面时，关紧下口活塞。 注意：整个操作要慢，不要将气泡压入吸附剂中，而且要始终保持吸附剂上有溶剂 4.上样 湿法上样 把被分离的物质溶在少量色谱最初用的洗脱剂中 小心加在吸附剂上层，注意保持吸附剂上表面仍为一水平面 打开下口，待溶液面正好与吸附剂上表面一致时，在上面撒一层细砂，关紧柱活塞。 4.上样 干法上样 选用一种目标物溶解度大而且沸点低的溶剂，取尽可能少的溶剂将其溶解。 在溶液中加入少量吸附剂，拌匀，挥干溶剂，研磨使之成松散均匀的粉末 轻轻撒在色谱柱吸附剂上面，再撒一层细砂。 5. 洗脱 在装好吸附剂的色谱柱中缓缓加入洗脱剂，进行梯度洗脱，各组分先后被洗出。若用50g吸附剂，一般每份洗脱液量常为50mL。现多采用薄层色谱或纸色谱定性检查各流分中的化学成分组成。含单一色点的部分用合适的溶剂洗净；仍为混合物的