细菌内毒素检测试验注意事项与误差分析.ppt

博康 2） 湿度 吸潮 灵敏度增高 挥发 1）操作时间 将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水稀释成2λ，进行鲎试验，37℃保温，分别在10、20、30、40、50、70min时观察，发现凝胶的形成状态随着时间的延长而坚固。因此夏天室温较高，如果试验操作时间太长，细菌内毒素与鲎试剂混合液不等进入反应仪器反应已开始，实际反应时间超过1小时。由于室温不同，冬夏季节、南北地区之间的操作误差将会很大。即使在25℃准室温下操作，操作时间拖得过长，细菌内毒素含量较高时，测定误差也不会小。 谢 谢! 鲎试剂反应机理图 判断假阳性的方法： 1、特异性鲎试剂法； 2、定量反应曲线分析法； 3、家兔模拟试验法。 2） PH值对反应速度的影响 常见现象：样品阳性不成立。 鲎试剂与内毒素反应的最适宜pH在6.5-8.0；pH ≤3 或≥10时，酶活性受到抑制。 相对活力 PH 7.0 PH对反应速度的影响: 影响酶原的激活； 影响酶分子的构象，过高过低的PH会改变酶的活性中心的构象，或甚至改变整个酶分子的机构使其变性失活。 故鲎试验时，供试品 pH 最好应预调和6.5-8.0 为好，必要时可用无内毒素的 HCl 或NaOH 稀溶液调节 pH 值。美国、日本药局方以及中国药典故2005版规定检品必须调节PH值6.0-8.0。 3） 金属离子和弱酸阴离子 离子对细菌内毒素测定结果影响较大，一方面阳离子如Fe3+、Al3+强度较大会引起内毒素的聚集造成内毒素局部浓度过高，同时还必须注意高价阳离子（如Fe3+）的氧化性对鲎试剂酶反应具有强抑制作用；重金属离子如Ag+、Cu2+、Pb2+可以使蛋白质变性而使酶失活；另一方面鲎试剂必须在二价阳离子Ca2+、Mg2+的参与下才能被激活形成凝胶反应。许多药物因PH值≥10时，其中的阴离子会吸收鲎试剂中的 Ca2+、Mg2+离子，使实验呈假阴性。 4） 药物浓度 1、10%葡萄糖注射液 2、白蛋白、小牛血清 3、医用透明质酸钠 4、中药类注射液 7 试验 操作规程 操作时间 操作顺序 操作细节 * * 细菌内毒素检测试验注意事项与误差分析 董光宴 工程师 一、实验注意事项 二、影响试验结果的因素分析 湛江博康海洋生物有限公司 一、试验操作注意事项 ——2010年版《中国药品检验标准操作规程》P310细菌内毒素检查法 实验前，须用肥皂洗手，用75％酒精棉球消毒。 在使用洗耳球、移液管取样时，应注意不要将洗耳球中的气体吹入溶液中，以防止气体中的内毒素进入供试液。 复溶0.5ml鲎试剂时，在旋涡混合器上点击1～3秒，促进鲎试剂的溶解。 由于凝集反应是不可逆的，所以在反应过程中及观察结果时应注意不要使试管受到振动，以免使凝胶破碎产生假阴性结果。 进行干扰实验时，标准对照系列和含内毒素的供试品溶液系列应同时进行，并使用同一支细菌内毒素标准品。 在进行鲎试剂灵敏度复核、干扰实验和供试品细菌内毒素检查时，各个实验中要求的对照应同时进行，并在实验有效的情况才能进行计算和判断。 在进行鲎试剂灵敏度复核、干扰实验和供试品细菌内毒素检查时，各个实验中要求的对照应同时进行，并在实验有效的情况才能进行计算和判断。 二、影响试验结果的因素分析 鲎试剂 细菌内毒素工作标准品 细菌内毒素检查用水 环境 实验器皿 实验人员 样品 试验 1 鲎试剂 质量标准：WS1-363（B-123）-91 性状、鉴别、检查、灵敏度测定、 用途、规格、贮藏 应用标准：干扰能力、稳定性 国外标准：无菌 1 鲎试剂 灵 敏 度：在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。 ——2010版《中国药典》 国外鲎试剂：灵敏度由FDA统一标定 1 鲎试剂 鲎试剂灵敏度复核的目的不仅是考察鲎试剂的灵敏度是否准确，也是考查检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。 因此要求每个实验室在使用一批新的鲎试剂进行供试品干扰实验或供试品细菌内毒素检查前必须进行鲎试剂灵敏度复核实验。 ——2010版《中国药品检验标准操作规程》 1 鲎试剂 外 观：本品为白色或类白色冻干块或粉末，在水和生理盐水中易溶。 干扰能力：指在药品、生物制品和血液制品中鲎试剂能准确测出被测物质内毒素的能力，既不能造成样品内毒素的漏检，也不能将其它物质错判为内毒素。 鲎试剂参考品：150603-201003，2.2ml/0.06EU 2 细菌内毒素标准品引起的误差 细菌内毒素标准品种类 细菌内毒素标准品效价误差 细菌内毒素标准品操作误差 细菌内毒素标准品的错误使用 1） 细菌内毒素标准品种