菌种的保藏和培养(第一讲).ppt

第一讲 微生物菌种保藏和培养 微生物菌种保藏技术 一、保藏原理 保藏原理：根据菌株生理生化特性，创造条件(低温、干燥、真空等)使菌体代谢活动处于休眠状态。 目的要求：经长期保藏后菌种存活健在；保证菌种不改变表型和基因型，特别是不改变菌种代谢产物生产能力；不被杂菌污染。 注意事项：防止变异；要保藏休眠体；培养基宜贫乏，碳源少；尽量减少对细胞的损伤。 二、保藏菌种的质量控制 目的要求：保藏菌种的方法都必须是长期可靠地保持菌种的优良性状不变。保藏时应定期检测菌种活力，以确定保藏培养物的保藏期限，遗传稳定性，保藏方法的可靠性。 测定指标：包括在保藏6个月、1年或更长时间后存活百分率(或存活单位)；细胞群体的形态学特征或一些特别的生化特征(如代谢产物的产生、酶活力、遗传特征及生化指标)应在菌种保藏前后保持同一性；以及实验室中、中试车间中和生产发酵中产品的稳定性，后者极为重要。 三、保藏方法 斜面低温保藏法 液体石蜡覆盖保藏法 液氮超低温保藏法 沙土管保藏法 冷冻干燥保藏法 普通冷冻保藏法 1、斜面低温保藏法(传代保藏) 保藏方法：将菌种定期在新鲜琼脂斜面、穿刺、疱肉（厌氧细菌用）基本培养基上传代，4℃左右保藏 保藏期限： 一般1～3月 注意事项：此法简单经济，可用于实验室中多数菌种的保藏；但易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变，应加以防治。不适宜作生产菌种的长期保藏方法 2、液体石蜡覆盖保藏法 保藏方法：将琼脂斜面或液体培养菌种物浸入液体石蜡(事先灭菌)中，4℃左右保藏 保藏期限：一般为1～10年 注意事项：对菌株应预先作石蜡培养试验，保藏株2～3年也应做一次存活试验。此方法简便有效，可用于霉菌、酵母、放线菌和好氧细菌的保藏 3、载体保藏 保藏方法：是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。 保藏期限：一般为1～10年。 注意事项：以沙土保存和滤约保存为主。 4、沙土管保藏法 保藏方法：制备沙土管?斜面培养?菌悬液?移入沙土管?干燥后熔封?低温保藏 保藏期限：因菌种而异，一般可达10年以上 注意事项：方法简单，保藏时间较长，复活方便；适用于保藏耐干燥的芽孢或孢子，对干燥敏感的细菌不宜采用 5、普通冷冻保藏法 保藏方法：将菌悬液或斜面培养物细胞将菌种加入菌种保护剂，密封于试管或EP管内，贮藏于冰箱的冷藏室或普通冰箱(-20℃)中 保藏期限： 一般1～2年 注意事项：经过解冻的菌株不宜二次保藏；保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应严格密封；不适宜微生物的长期保藏 5-1、液氮超低温保藏法 保藏方法：用冷冻保护剂制备菌悬液，混匀，取0.5～lml分装玻璃安瓿管，酒精喷灯封口；先于5℃冰箱中3min，后置于金属容器，以1-2℃/min快速冷冻至细胞冻结点(-35℃左右)，再以1℃/min控速冷冻至-50℃；迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或气相(-156℃)中保存 保藏期限：一般可达10年以上 复苏方法：从液氮罐中取出后立即冰浴10min；再迅速将安瓿管置于38-40℃水浴中，急速溶解后，开启安瓿接种培养 注意事项：保护剂最终浓度为10％(甘油)或5％(二甲亚砜)；甘油为高压蒸汽灭菌，二甲亚砜最好为过滤灭菌 安瓿管 6、冷冻干燥保藏法 保藏方法：将混有保护剂的菌液入安瓿管后速冻至-70℃，用冷冻干燥机-40℃下抽真空，使真空度减压到2.67～4.00Pa条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，菌种干燥成粉后密封安瓿管，低温避光保藏 保藏期限： 10年以上 注意事项：冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，如脱脂乳和蔗糖；忌猛烈开启；冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输销售，应用广泛 四、细菌常用的几种保存方法 1、细菌穿刺培养： 一般细菌保存于穿刺培养物可以维持两年。具体方法如下：用灭菌接种针挑取分散良好的单菌落，针缓慢穿过琼脂到达瓶底，连续几次，盖上瓶盖拧紧，做好标记。室温下存放于暗处。（最好一点可以将瓶盖放松，在适当温度下培养过夜，再拧紧瓶盖并加封Parafilm膜，室温或最好在4度避光保存）。 2、细菌甘油保存（1）： 在液体培养基中生长的细菌培养物：取0.85ml细菌培养物，加入0.15ml高压灭菌甘油，振荡培养物使甘油分布均匀，然后转移到标记好的保存管内，密封，在乙醇－干冰或液氮中冻结后再转至－70度长期保存。在复苏时，用灭菌接种针刮取冻结的培养物表面，然后立即把黏附于接种针上的细菌划于含适当抗生素的LB琼脂平板表面，于37度过夜。 2、细菌甘油保存（2）： 在琼脂平板上生长的细菌培养物：从琼脂平板表面刮下细菌放入装有2mlLB的无菌试管内，再加入等量的含有30％灭菌甘油的LB培养基，振荡使甘油完全分布均