血清蛋白的聚丙烯酰胺电泳.ppt

实验九 血清蛋白聚丙烯酰胺 垂直板电泳 （polyacrylamide gel electrophoresis，缩写为PAGE） 一、实验目的 ＊学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 ＊掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术 (一)电泳的含义 带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷的电极作定向移动的现象称为电泳。电泳的应用 1. 分离各种有机物：如蛋白质、酶、核酸等 2. 分析某种物质的纯度及分子量 3.电泳技术与层析法结合可用于物质的结构分析 4.免疫电泳可提高对蛋白质的鉴别能力 二、实验原理 待分离大分子的性质 ：所带的电荷、分子大小和形状。 分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。 电场强度：过高，产热，蛋白变性导致不能分离； 缓冲液水分蒸发过多，离子强度增加；过低，电泳时间增加，扩散。当需要增大电场强度以缩短电泳时间时，需附有冷却装置。 电渗：在电场中液体对固体支持物的相对移动；当电渗方向与电泳方向一致时，会加快颗粒泳动速度，反之，当两者方向相反时，会减慢颗粒泳动速度。 电泳的影响因素 支持介质的筛孔 ：筛孔越小，则颗粒在移动的过程中所受到的阻力也就越大。 缓冲液pH和离子强度：pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大 ；但是pH过高或过低引起蛋白变性；缓冲液通常要保持一定的离子强度，强度过低，则缓冲能力差，不易维持pH恒定，离子强度过高，在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），降低了蛋白质的带电量，使电泳速度减慢。一般所用离子强度为0.02～0.2之间。 (二) 聚丙烯酰胺凝胶电泳 以聚丙烯酰胺凝胶作支持介质的一种电泳方法,由丙烯酰胺(Acr)单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂作用下，聚合交联而成的三维网状结构凝胶。当Acr和Bis遇到自由基时，便能聚合。引发自由基产生的方法有两种：化学法和光化学法. 1.凝胶聚合催化体系 化学聚合的引发剂是过硫酸胺（简称AP）。在催化剂N，N，N′，N′-四甲基乙二胺 （简称TEMED）的作用下，由AP形成氧自由基而引发聚合反应，由于反应需要TEMED的游离碱基，所以在低pH下，聚合反应可能延迟甚至被阻止。增加TEMED或过硫酸铵浓度可以增加聚合反应速度，但速度过快影响制板操作，两者浓度过高也影响蛋白质活性。   （1）光催化：核黄素 （2）化学催化：AP-TEMED 催化体系 TEMED（四甲基乙二胺）催化AP（过硫酸胺）生成硫酸自由基： S2O82－ 2SO4·ˉ 硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链： Bis将单体长链间连成网状结构： 化学聚合的凝胶孔径较小，常用于制备分离胶，重复性好。聚合反应受各种因素的影响： ? 催化剂和加速剂的浓度 ? pH 碱性条件 ? 温度 ? 分子氧 ? 杂质 分子量范围 适用的凝胶浓度/(%) ?104 20-30 1-4×104 15-20 1-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10 ?5×105 2-5 蛋白分子量范围与凝胶浓度的关系 2. 凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关 3.聚丙烯酰胺凝胶有下列特性 (1) 在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； (2) 化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，很多溶剂中 不溶； (3) 对pH和温度变化较稳定； (4) 几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致， 则样品分离重复性好； (5) 样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g； (6) 凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓 度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径； (7) 分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛 和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖 电泳等有更高的分辨率。 4.聚丙烯酰胺凝胶种类 (1)连续系统与不连续系统两大类 不连续系统:是指使用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系的电泳方式，在电泳分离过程中，由于浓缩胶的堆积作用，可使样品在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，对样品进行浓缩，然后在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离，既存在电荷效应，也有分子筛效应。虽然制胶操作难度