酶失活动力学.ppt

* 酶的失活动力学 ● 酶是一种不稳定的物质，常因温度，pH等因素的影响而 产生不可逆的活力下降。 ● 一般胞外酶较为稳定，而胞内酶在外部环境中容易失活。 ● 酶在保存和参与反应时均可能失活；酶在保存过程中的失 活又称为酶的稳定性，失活越快，说明酶的稳定性降低。 ● 酶的热失活是最重要的一种酶失活形式，下面主要讨论此 种失活的动力学。 一、未反应时的热失活动力学 ●测定酶未反应时的热失活动力学方法：在一定条件下，使酶溶 液恒温保持一定时间，然后在最适宜的pH和温度下测定残存的 酶活力，即残存酶活力。在不同温度下反复测定，即可得到一 条曲线。该曲线可以表示酶的失活特性，称为酶的热失活曲线。 若改变保温时间，则会得到不同的热失活曲线（图1-1)。 ●如果要了解酶在未反应时的失活速率，可将残存的酶活力对其 失活时间作图，则又可得到一条曲线（图1-2）。 图1-1 不同温度下的酶失活曲线 图1-2 不同时间下的酶失活曲线 这些曲线反应了酶的生活规律。酶的热变性失活很复杂，一般 将其分为可逆失活与不可逆失活两类，并提出了多种失活动力 学模型。下面主要介绍一步失活模型。 1.一步失活模型（one step model) 式中： E—活性酶 D—失活酶 kd—正反应的速率常数 kr—负反应的速率常数 则活性酶的浓度随时间的净减少率或失活反应方程式可表示为： 系统中酶的总浓度若以cE0表示，则存在下述关系式： cE0=cEt+cD (a) (b) 将式(b)代入式(a)，并利用边界条件t=0，cE0=cEt积分，经整理可得下式： (c) 对不可逆失活反应，kr=0,可得 cEt=cE0exp(-kdt) (d) 多数酶的热失活服从式(d)，kd可称为一步失活常数或衰变常数，单位 为(时间)-1。kd的倒数称为时间常数td。当cEt为cE0的一半的时间称为半 衰期，用t1/2表示。kd、td和t1/2之间的关系为： 2.多步失活模型（multi-step model) A 多半串联失活模型：酶的失活经历多步，即D→F→E。 B 同步失活模型：全部酶分子可划分为热稳定性不同的若干 个组分，每个组分均符合一步失活模型。该模型全部酶中残 存酶活力的比率为： 式中：cE0表示酶的初始浓度；xi表示失活速率常数为ki的酶组 分的分率。因此， 3.温度对酶失活的影响 对一级失活模型，有失活反应Arrihenius方程 式中：kd表示衰变常数；Ad表示失活反应Arrihenius方程的前指因子； Ed表示失活反应活化能。 一般蛋白质的变性或失活的活化能为125kJ.mol-1，高于一 般化学反应的活化能（20~83kJ.mol-1）,这意味着酶失活对 温度十分敏感。同时考虑温度和时间对酶失活影响的关系式 二、反应时的酶热失活动力学 ●酶在反应中的稳定性称为操作稳定性，可通过分批测定、 连续测定及圆二色谱分析等方法测定。作不同温度下反应 转化率随时间的变化曲线，即反应过程曲线，如图2-1所示。 图2-1 不同温度下酶促反应过程曲线 (a) 以温度T为参数，转化率X与时间t的关系曲线； (b) 以时间t为参数，转化率X与温度T的关系曲线 由图(a)知时间一定时，随着温度的升高，反应速率增大， 因而转化率增大；但当温度高到某一值时。其转化率反而 减少。因为当温度升高到某一值时，酶的热失活速率也在 加速，致使有活力酶的量在减少，因而反应速率下降，最 终为零。 由图(b)知：对于某一反应时间，存在一转化率最高的温度， 该温度称为最佳温度。不同的反应时间，有不同的最佳温度。 最佳温度是温度对酶催化速率和酶失活速率双重作用的结果。 就底物浓度的变化对酶失活的影响，提出了下述模型： 从上述机制看出，无论是游离酶，还是酶的复合物，均有可能 失活，其失活速率方程可表示为: 式中： σ表示底物对酶失活的影响系数；cEf表示游离酶浓度。 根据上述模型可知： （1）当σ=0时，反应时酶失活速率达到最低。从反应机制中可以看出，复 合物ES完全不失活，或者说酶完全被底物所保护。 （2）当σ=1时，反应时与未反应时酶的失活速率完全相同。从反应机制中 可以看出，复合物ES与游离酶E失活速率常数完全相同，或者说底物对酶 失活没有影响。 （3）0σ1时，反应时酶失活速率低于未反应时酶失活速率。从反应机制 中可以看出，复合物ES失活速率常数低于游离酶E，或者说底物对酶失活有 部分保护作用，能在一定程度上一只酶的失活。 （4