采用磁性载体制备固定化酶反应器的载体颗粒对蛋白酶解性能的研究.ppt

采用磁性载体制备固定化酶反应器的载体颗粒对蛋白酶解性能的研究 酶的选择 传统溶液酶解的缺点 1.酶解时间长 2.自身酶解 3.不能重复使用 4.酶自身不能去除 固定化酶酶解的优点 1.酶解时间短 2.自身不易酶解 3.重复性高 4.容易分离 固定化酶的载体 SiO2 玻璃陶瓷 磁性纳米颗粒 等等 载体的选择SiO2包裹的磁性纳米颗粒 纳米颗粒本身易氧化，表面羟基不足，但通过SiO2包裹使得纳米颗粒进行改性，具有良好的化学稳定性和独特的生物相容性。且其比表面积大、具有磁性而便于分离等特性。 关于团聚现象 由于磁性颗粒本身粒径太小，在被SiO2包裹过程中因存在磁偶极子引力作用及粒子间相互作用容易出现团聚现象。 SiO2包裹的磁性纳米颗粒的制备 溶胶凝胶法： 乙醇体系中用氨水催化水解正硅酸得到 固定化酶反应器的制备 通过ATRP（引发原子转移自由基聚合反应）进行链引发，化学修饰粒径不同的磁性纳米颗粒。 酶的选择 胰蛋白酶 酶解部位：赖氨酸，精氨酸 酶解蛋白的选择 MYO 马心肌红蛋白 BSA 牛血清白蛋白 腾冲嗜热菌全蛋白 标准蛋白 实验思路 一、2种方法（传统溶液酶解和胶内酶解）酶解3种蛋白 二、质谱鉴定酶解结果 三、比较传统溶液酶解和胶内酶解 四、分析不同粒径对团聚、酶解效率、漏切位点影响 蛋白质酶解 MYO——无二硫键 BSA——有二硫键 腾冲嗜热菌全蛋白 热变性 加DTT，IAA变性 超声破碎 IMER酶解 质谱鉴定 质谱鉴定 MALDI-TOF质谱鉴定 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 HPLC-ESC-LTQ-FT质谱鉴定 毛细管高效液相色谱-电喷雾-线性离子阱-傅里叶变换离子回旋共振质谱 HPLC原理 溶于流动相(气体)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(固体颗粒表面液体)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。 结果与讨论 一、粒径与酶负载量 测定酶溶液在固定前后的浓度差（OD280差） 是亚微米级的3.5倍，原因：比表面积大，酶结合位点多 纳米级 亚微米级 粒径 20nm 0.2μm 0.5μm 酶负载量/μg/mg 21.65 6.08 6.10 21.65 结果与讨论 二、粒径与酶解效率 结论：不同粒径的酶解效率接近 结果与讨论 三、传统方法和IMER酶解效率比较 原因：避免自身酶切，提高酶与蛋白的比例 IMER 传统 酶解MYO时间 1min 12h 酶解效率 98% 85% 结果与讨论 四、酶量与蛋白量比例 酶量/蛋白量1:1 0漏切位点肽段数：50 蛋白序列覆盖率70% 酶量/蛋白量1:1 酶解效率明显下降 结果与讨论 五、粒径与IMER稳定性和重复性 重复性：多次试验结果相差不大 稳定性：覆盖率波动范围不大 结果与讨论 六、酶漏切现象考察 IMER 传统 0漏切位点肽段数 50 31 蛋白序列覆盖率 70% 57% 结果与讨论 七、粒径与IEMR回收率 对特征肽段提取的离子色谱峰面积进行比较 相对回收率高于100%原因： 传统酶解不完全及过度酶解 LFTGHPETLEK肽段相对回收率高的原因： 疏水性弱 结果与讨论 八、腾冲嗜热菌全蛋白的酶解 传统酶切与IMER酶切肽段数与蛋白相当 传统酶切与IMER酶切漏切位点类似 传统酶切12h,IMER酶切5min IMER高效 总结 * * * * * * * *