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WB检测全攻略Western Blot,对于任何一个科研君都不陌生，但是，为甚么别人的实验时间短、跑胶快、成像显影辣么好看活生生的羡慕，嫉妒，hen (哼)，足足被甩了几篇SCI…内情你知否？除了实验精细化操作，选择合适的实验试剂，还有呢？当然离不开你的优化设计你对关键步骤的步步为营。本文旨在通过提供建议，帮助您在短时间、以更少的终端用户优化调整得到预期结果，提升免疫印迹效果。PS：科研是不断进步的过程，有不当之处，望指正。何为蛋白印迹（WB）蛋白印迹也称作免疫印迹，是一种被广泛应用并得到公认的技术，用于检测细胞或组织提取物中的蛋白表达水平。这一技术利用抗体与特定待检测蛋白的结合，测定生物样本中的蛋白水平。抗体与其靶点蛋白表位的精确结合可用于检测蛋白质中具有高度特异性的氨基酸序列。一句话讲完WB：就是抗原抗体反应！Western Blot 可以：1.从蛋白质混合物中检出目标蛋白质；2.定量或定性确定细胞或组织中蛋白质的表达情况；3.用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用后续分析。▲WB涉及的领域▲WB操作关键步骤以下，会从关键步骤入手，我们将给出试剂和实验过程的建议，逐一介绍每个步骤中的一些关键注意点以及给出对应优化后的图表，供大家参考一、裂解产物制备1.组织裂解常见破碎组织的方法： 机械法、匀浆法、超声波破碎解、研磨法，反复冻融法等；实验室常用的破碎方法：1.超声波；2.电动研磨；3.磁珠破碎法。（注意磁珠高速旋转时产生的热量比较多，需提前把机器放在冰箱制冷）以上主要注意发热引起的蛋白变性和聚集，操作过程中尽量减少细节上的差异，这样才能保证实验结果的重复性比较一致。2.细胞裂解一般裂解液包含以下几个组分:1. 缓冲系统；2. 盐离子；3. 离液剂； 4. 蛋白酶抑制剂；5. 还原剂▲根据目的蛋白选择合适的裂解液▲常见蛋白酶磷酸酶抑制剂二、凝胶电泳1.加入足量的样品和分子量大小标记物SDS根据蛋白电泳迁移率将其分离，迁移率是蛋白大小和电荷的函数。我们建议在预制 Tris-Glycine 小孔胶上样20-40μg 全细胞裂解液或100ng纯化蛋白，根据目标蛋白的表达量优化上样量。对于大分子量靶标，我们建议采用 Tris-Acetate 凝胶和相关缓冲液。应在待测样本附近的泳道始终加入分子量标记物，作为参考点。分子量标记物（或梯状条带）是已知分子量的纯化蛋白的混合物。采用预染色标记可以看见电泳过程中蛋白迁移的距离，随后确认经电转移至膜。采用生物素标记物可以看见膜上的梯状条带和抗体靶标。2.选择合适的蛋白marker预染蛋白marker应用：?实时监控SDA中的蛋白迁移?检验western转膜效率?对蛋白大小进行初略鉴定?呈彩色且转膜效果好▲电泳凝胶制备参考浓度三、转膜1.湿转移把蛋白从凝胶转移至膜上的湿转移是指把滤纸-凝胶-膜-滤纸“三明治”完全浸入缓冲液中。使用此方法时，在浸没的情况下通过电泳转移至 0.2 μm 孔径硝酸纤维素膜，在冷却的含 20% 甲醇的转移缓冲液中转膜，70V，1.5小时。2.半干转移把蛋白从凝胶转移至膜上的半干转移是指将浸满缓冲液的滤纸-凝胶-膜-滤纸“三明治”系统，置于本应干燥的阳极和阴极板上。在这一系统中，转移在桌面上进行，在室温条件下约15-60分钟。转移低分子量和高分子量蛋白时这一系统均运转良好，相较于湿转移所需缓冲液更少，但是在某些情况下会产生更高的背景染色。（转膜时不离人，监测电流电压）3.干转移把蛋白从凝胶转移至膜的干转移是指不额外加入缓冲液的系统，因为阳极和阴极板系统中含有缓冲液基质。对于较大分子量蛋白，观察到信号差异最大，表明转移效率低。（注意：在样本量有限或待检测蛋白低内源水平的情况下，干转移方法会限制您分析的灵敏度。）▲Trans Blot四、封闭建议转移之后迅速在 Tris-Buffered Saline (TBS) 中洗涤膜，以便移除残留的转移缓冲液，随后在室温条件下含5% 脱脂牛奶的 Tris Buffered Saline 和 Tween? 20 去污剂 (TBST)中封闭1小时。这一封闭步骤有助于降低非特异性一抗结合并降低背景。应避免膜封闭时间过长，因为这会掩盖抗原表位，阻止抗体结合。封闭后在TBST 中洗涤5分钟。五、一抗、二抗孵育1.加一抗与抗原结合?一抗应在含5% BSA 或5% 脱脂牛奶的 TBST 缓冲液中稀释。?一抗孵育时间会有很大的差别，具体取决于研究人员采用的操作流程。建议在4℃过夜孵育一抗。（过夜孵育提高抗体结合）?免疫印迹操作流程的另一个存在差异的方面是洗涤和稀释缓冲液。推荐抗体稀释缓冲液和洗涤步骤使用TBST。(TBST 缓冲液产生更强的信号)2.加二抗与一抗的结合?建议在含 5% 脱脂牛奶的 TBST 中稀释二抗。?因为脱脂牛奶的