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第五章 聚合酶链式反应 第五章 聚合酶链式反应 PCR 基因放大连琐反应 第五章 聚合酶链式反应 第五章 聚合酶链式反应 第五章 聚合酶链式反应 Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现，1987 获专利。 1986，PE-Cetus公司发现并纯化出适用于PCR的耐热DNA聚合酶 1987，PE-Cetus公司推出PCR自动化热循环仪 1988，PE-Cetus公司获得基因工程方法生产的耐热DNA聚合酶 1989，PE-Cetus公司获得PCR方法、天然Taq酶及重组Taq酶三项专利 1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。 第五章 聚合酶链式反应 第五章 聚合酶链式反应（ PCR） 第一节 聚合酶链式反应扩增原理 第二节 聚合酶链式反应体系 第三节 聚合酶链式反应引物设计原则 第四节 聚合酶链式反应技术类型 第五节 聚合酶链式反应技术应用 第一节 PCR扩增原理 第一节 PCR扩增原理 第一节 PCR扩增原理 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。类似于DNA的体内复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 ①模板DNA变性：模板DNA经93℃左右加热一定时间后，双链DNA模板或经PCR扩增形成的双链DNA解离成为单链。 ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。 ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的单链。 变性--退火--延伸三步骤的重复循环，就可获得更多的“模板互补链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。多次循环后目的基因扩增放大几百万倍。 第一节 PCR扩增原理 DNA模板的变性：将待扩增DNA加热到950C左右，使双链DNA解开成为单链（即：使模板DNA或延伸后的双链DNA发生热变性 ），并游离于反应体系中作为模板； 模板与引物的结合（退火或复性）： 将体系温度降至合适温度（550C左右），使加入的引物与模板DNA两端（3ˊ端）碱基序列互补结合。（由于加入的引物量远多于模板量，所以引物与模板的结合比例远大于模板自身的复性）； 引物延伸： 将体系温度升到720C左右，Taq聚合酶催化dNTP按碱基互补原则连接在DNA引物3ˊ端，使引物延伸，形成两条与模板互补的新链。 　　以上为一次PCR循环（变性、复性和延伸） 　　　（新合成的链可作为下一轮循环的模板） 　按照上述步骤重复操作，PCR产物呈指数扩增。模板DNA 扩增倍数T=2n (n: 循环次数)。 第一节 PCR扩增原理 第一节 PCR扩增原理 第一节 PCR扩增原理 第二节 PCR体系 一、PCR反应操作程序 以30μl体系为例 各种成分的实际用量应根据实验者选用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓度进行核算 　　　10×buffer： 1×30 / 10 = 3μl 　　 MgCl2: 1.5×30 / 25 = 1.8μl 　　dNTPs: 0.2×30 / 10 = 0.6μl 　　引物 P： 0.4×30×2 / 10 = 2.4μl 　　 Taq 酶(5U/μl)：1 / 5 = 0.2μl 　　模板： 1μl 　　水： 30-3-1.8-0.6-2.4-0.2-1=21μl 第二节 PCR体系 一、PCR反应操作程序 操作示例： 5份标本 总体积 30μl ×6 = 180μl 1. 取一 0.5 ml Ep 管，依次加入下列试剂： 10×buffer： 3μl ×6 = 18μl MgCl2: 1.8μl×6 = 10.8μl dNTPs: 0.6μl×6 = 3.6μl 引物 P