细胞计数总结.doc

细胞计数与存活测试 1. 原理： 1.1. 计算细胞数目可用血球计数盘或是Coulter counter 粒子计数器自动计数。 1.2. 血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber 中细刻9 个1 mm2 大正方形， 其中4 个角落之正方形再细刻16 个小格，深度均为0.1 mm。当chamber 上方 盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用时，计 数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml 中之细胞 数目。 1.3. 存活测试之步骤为dye exclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细 胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue 染料，如果细 胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。 2. 材料： 2.1. 0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061) 2.2. Erythosin bluish stain 取0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及0.05 gram preservative methyl paraben (Sigma H-3647) 溶于100 ml Ca++/Mg++ free saline 2.3. 血球计数盘及盖玻片(Hemocytometer and coverslip) 2.4. 计数器(counter) 2.5. 低倍倒立显微镜 2.6. 粒子计数器(Coulter counter, Coulter Electronics) 3. 步骤： 3.1. 取50ml 细胞悬浮液与50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 等体积混合均匀于 1.5ml 小离心管中。 3.2. 取少许混合液(约15ml) 自血球计数盘chamber 上方凹槽加入，盖上盖玻片，于 100 倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色- Erythrosin bluish)。 3.3. 计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypan blue 等体积混合)，最后乘以104 ，即为每ml 中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线 上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。 4 大格*细胞总数x 2 x 104 / 4= 细胞数/ml *每一大格的体积= 0.1cm x 0.1cm x 0.01cm = 10-4 ml 3.4. 若不用血球计数盘，可用Coulter counter 作自动计数，惟无法辨别死细胞或活细 胞。 3.5. 范例： T75 monolayer culture 制成10ml 细胞悬浮液，取0.1 ml 溶液与0.1ml trypan blue 混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之 细胞数目。 活细胞数/方格：55 ,62, 49, 59 死细胞数/方格：5, 3, 4, 6 细胞总数= 243 平均细胞数/方格= 60.75 稀释倍数= 2 细胞数/ml：60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106 细胞数/flask： 1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 106 存活率：225/243﹦92.6 % 关于血球计数板的使用及问题讨论 摘要：《培养液中酵母菌种群数量的动态变化》是新课标教材“必修3：稳态与环境”中的学生分组实验，该实验需要测定酵母菌细胞数量，教材采用显微镜直接计数法，需要学生学会使用血球计数板进行准确计数。但是该计数方法，对高中教师来说，比较陌生，对学生而言，使用的难度较大。本文通过结合《培养液中酵母菌种群数量的动态变化》这一实验，对血球计数板的使用原理和操作步骤、方法等进行详细地介绍，并分析有关血球计数板的命题。 关键词：血球计数板 使用原理、方法 问题讨论 《培养液中酵母菌种群数量的动态变化》是新课标教材“必修3：稳态与环境”中的学生分组实验，该实验通过探究培养液中酵母菌种群数量的变化，尝试建构种群增长的数学模型并用数学模型解释种群数量的变化，说明制约种群个体数量变化的种群外部环境因素和种群内部因素。 在该实验中，需要测定酵母菌细胞数量。测定细胞数目的方法有显微镜直接计数法、平板菌落计数法、光电比浊法等，教材采用的是较为简便、快速、直观的显微镜直接计数法。因此，学会使用血球计数板进行准确计数，是该实验成功与否的关键。 虽然不同版本的教材推荐使用的血球计数板的规格不同，人教版建议使用2mm×2mm×0.1