基因工程-第3章-核酸操作的基本技术.ppt

第三章 核酸操作的基本技术 3.1 碱抽提法提取DNA 碱变性抽提法又称碱抽提法或碱裂解法，是一种用的最广泛的制备质粒DNA的方法，是当今分子生物学研究中的常规方法。碱变性抽提法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值达到12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当以pH4.8 的NaAc高盐缓冲液调节其Ph至中性时，变性的质粒ＤＮＡ又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体ＤＮＡ不能复性 而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体ＤＮＡ与不稳定的大分子ＲＮＡ、蛋白质－ＳＤＳ复合物等一起沉淀下来而被除去。 碱变性抽提质粒ＤＮＡ，除了菌体培养、质粒扩增和收集菌体外，其提取过程大体分为三个步骤：（１）从染色体ＤＮＡ中分离质粒ＤＮＡ。（２）去除质粒ＤＮＡ中的ＲＮＡ。（３）进一步纯化质粒ＤＮＡ，去除蛋白质等杂质。 3.1.1 碱抽提法所用各类试剂的生化作用 （１）溶菌液中的溶菌酶是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的Ｂ－１，４糖苷键，因而具有溶菌作用。 （２）NaOH-SDS液：核酸在pH５.９的溶液中是稳定的，但当pH１２ 或pH３时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。ＳＤＳ是离子型表面活性剂，它可以溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜、解聚 细胞中的核蛋白，还能与蛋白质结合成为Ｒ－Ｏ－ＳＯ－３…R+－蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是ＳＤＳ能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止它影响Raase的活性。 （３）ＮaＡc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。目的是把pH12.6的抽提液调节至中性，使变性的质粒ＤＮＡ能够复性，并能稳定存在。而高盐的３mol/L　NaAc有利于变性的大分子染色体ＤＮＡ、ＲＮＡ、以及ＳＤＳ－蛋白复合物的凝聚而沉淀之。 （４）乙醇：ＤＮＡ溶液是ＤＮＡ以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去ＤＮＡ周围的水分子，ＤＮＡ失水而易于聚合。一般实验中，是加２倍体积的无水乙醇与ＤＮＡ相聚合，其乙醇的最终含量占６７％左右。 （５）ＴＥ缓冲液：在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑ＤＮＡ的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。采用Tris-HCL的缓冲系统，由于缓冲液是Tris H+/Tris,不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存ＤＮＡ时，大都采用Tris-HCL系统，而ＴＥ缓冲液中的ＥＤＴＡ更能稳定ＤＮＡ的活性。 （６）酚－氯仿：酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白质失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的ＤＮＡ分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。 （７）异戊醇：在抽提ＤＮＡ时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止分子相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中泡沫的产生。一般采用氯仿与异戊醇之比为２４：１。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为２５：２４：１。同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相、中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。 （８）饱和酚：因为酚与水有一定的互溶，苯酚用水饱和的目的是使其抽提ＤＮＡ过程中，不致吸收样品中含有ＤＮＡ的水分，减少ＤＮＡ的损失。用Ｔris调节pH为８是因为ＤＮＡ在此条件下比较稳定。 质粒DNA的小规模提取－碱裂解法 1）接种一单菌落于3ml含70μl/ml Amp的LB液体培养基中。200转/分37℃振荡培养过夜（约8－10h）。12000rpm离心1min收集细菌。 2）用STE重悬细菌沉淀，12000rpm离心5min，弃上清。 3）将细菌沉淀重悬于100μl冰预冷的溶液I中，加入200μl新配制的溶液II，温和转动使之混匀，冰浴2min。 4）加入150μl溶液III，将管倒置摇荡1min，冰浴5min。 质粒DNA提取溶液Ⅰ： 50mM葡萄糖，25mM Tris.Cl（pH8.0），10mM EDTA（pH8.0），高压灭菌，4℃保存。 质粒DNA提取溶液Ⅱ：0.2M NaOH，1% SDS，现配现用。 质粒DNA提取溶液Ⅲ：5M 乙酸钾溶液60ml，冰乙酸11.5ml，灭菌水28.5ml。 5）12000rpm离心8min，小心取上清于离心管中。加等体积酚：氯仿抽提一次。 6）取上清液加入1/5体积5M的乙酸胺，再加入2倍体积无水乙醇，12000rpm离 心5min，弃上清，加入70％乙醇沉淀。 7）离心弃