基因工程的主要操作技术及原理.ppt

聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，N—methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N?，N?—四甲基乙二胺(N，N，N?，N?—tetramethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，简称AP)或核黄素(ribofavin即vita min B2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。 聚丙烯酰胺凝胶有下列特性： 在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； 化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶； 对pH和温度变化较稳定； 几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好； 样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g； 凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径； 分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。 凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关 分子量范围与凝胶浓度的关系 分子量范围 适用的凝胶浓度/(%) 蛋 白 质 ?104 20-30 1-4×104 15-20 1-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10 ?5×105 2-5 核酸(RNA) ?104 15–20 104–105 5-10 105-2×106 2-2.6 缓冲液：TBE 凝胶聚丙烯酰胺：丙烯酰胺/ 亚甲双丙烯酰胺（29：1）；TEMED和过硫酸铵（ 10％ ）。 染色：一般为银染 聚丙烯酰胺凝胶电泳-DNA 缓冲系统的选择 一般情况下，在被分析的蛋白质稳定的pH范围，凡不与SDS发生相互作用的缓冲液都可以使用，但缓冲液的选择对蛋白质的分离和电泳的速度是非常关键的。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳-蛋白质 电泳缓冲液的种类：1、磷酸缓冲液2、Tris-醋酸钠缓冲系统3、咪唑缓冲液系统： 比磷酸缓冲系统的导电性低，电泳速度要比后者快一倍。4、尿素系统： 适用分子量低于15kD的蛋白样品。5、Tris-甘氨酸系统： 使用最多的缓冲液6、Tris-硼酸盐缓冲液： 测定糖蛋白的分子量 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS)，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用SDS测定蛋白质分子量。 SDS及其作用 十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS)，是一种阴离子去污剂。它在水溶液中以单体（monomer）和分子团（micellae）的混合形式存在。 作用：破坏蛋白质分子之间以及其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变原有的构象，保证蛋白质分子与SDS充分结合而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。 分离胶聚合之后 纹理和脱尾现象：样品溶解不佳，加样前离心。 蛋白带过宽：邻近泳道的蛋白加样量过多。 指示剂成微笑符号：凝胶不均匀冷却。 指示剂成哭泣符号：凝胶和玻璃板组成“三明治”底部有气泡。 凝胶时间不对：凝胶太慢可能是TEMED、 APS剂量不足或失效；凝胶太快：TEMED、 APS用量过多，胶太硬易裂。 SDS常见问题 在1983年，美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis发明的。 PCR是一种在体外快速扩增特定基