实验3 B细胞杂交.ppt

实验目的 熟悉细胞杂交及单抗制备的基本原理； 掌握细胞融合的基本操作 乳化：将抗原与佐剂混合的过程（1:1） 乳化的方法： 研磨； 注射器混合法； 快速乳化法：利用超声波粉碎器 乳化好的标志：取一滴乳化剂滴入冷水中呈现球形而不分散。如出现平展扩散即为未乳化好。乳化过的物质放置一段时间（在保存期内）出现油水分层也是未乳化好的表现 免疫：皮下多点及腹腔注射 思考题 细胞融合后有几种状态的细胞存在？ HAT培养基选择培养的原理与目的是什么？ 免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后的细胞类型 未发生融合骨髓瘤细胞及其同核融合体：其DNA合成的主要途径被A阻断后，由于缺乏HGPRT而不能利用培养液中的H，虽TK可利用T，但不能完成完整的DNA合成过程； 未发生融合的脾细胞及其同核融合体：培养液中不能长期生长，7天左右即死亡 脾细胞和骨髓瘤细胞的异核融合体：即杂交瘤细胞，既从脾细胞获得了HGPRT和TK，从而利用培养液中的H和T合成DNA，又从骨髓瘤细胞获得了无限增殖的能力，因此能在HAT选择培养液中生存下来。 * * B淋巴细胞杂交 实验三 杂交瘤技术的基本原理 具有分泌功能的B细胞难以在体外长期存活。利用细 胞融合技术，将免疫后的B细胞与在体外能长期存活的 骨髓瘤细胞进行融合，经过选择培养获取杂交细胞， 这种细胞称为杂交瘤细胞（Hybridoma） 该细胞的特点： 1、具有免疫B淋巴细胞分泌特异性mAb的能力； 2、具有骨髓瘤细胞无限增殖的能力 故应用杂交瘤细胞生产单克隆抗体 杂交的目的——制备单克隆抗体 实验原理 杂交瘤技术基本过程示意图 材料与器材 1、Balb/C小鼠，6~8周龄，雌性 2、细胞：对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0 3、试剂：RPMI1640培养液、优质新生牛血清、HAT选择性培养基、细胞融合剂（PEG）、佐剂、可溶性抗原 4、仪器：温控低速离心机、倒置显微镜 6、器材：10 ml塑料针筒、剪刀与镊子等 操作步骤 实验步骤：抗原乳化 操作步骤 实验步骤：免疫动物 处死小鼠，固定于解剖架上打开腹腔，取出脾脏。置于120目的钢丝网中，将网移入盛有20ml生理盐水的平皿中，用注射针芯轻轻压磨，使其成为单个细胞悬液，吸取1ml细胞悬液（约5×106细胞）, 与骨髓瘤细胞SP2/0（5×105细胞）混合，离心后弃上清 骨髓瘤细胞:免疫脾细胞为1:10 一个脾脏可获约108个细胞 实验步骤：免疫脾细胞的制备 操作步骤 1、取 PEG（polyethylene glycol，聚乙二醇）溶液1.0ml 缓慢加入混合细胞中,边加边搅拌； 2、静止1分钟； 3、加HAT培养基4ml； 4、取融合细胞悬液1ml,滴加在96孔培养板中，每孔1滴（约50μl）； 5、显微镜下观察融合细胞的状态 实验步骤：细胞的融合 操作步骤 注意事项 1、取小鼠脾脏细胞时，要正确抓住小鼠，以免被其咬伤 2、脾脏细胞和骨髓瘤细胞混合离心后，要彻底弃去上清 3、融合时要缓慢加入PEG融合，并边加边轻轻搅拌，以保证细胞与融合剂的充分接触 4、观察融合细胞时，轻拿轻放，以免克隆细胞分散造成判断错误 5、严格无菌操作、防止污染 6、防止原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性细胞：大量冻存、定期再克隆，定期抗体检测 实验结束后，将实验小鼠放入垃圾袋，使用过的剪刀、镊子、试管、吸管及培养板等冲洗干净，放回原处，谢谢合作！ 动物免疫 BALB/C origin, 6-8wk, female mouse Choice of animal 1wk 抗原50μg/只，溶于300μl 生理盐水中，加入等量福氏完全 佐剂（CFA）充分乳化，分颈部皮下多点及腹腔注射； 3wk 抗原的剂量及注射的部位同上，仅将全佐改为半佐（IFA）； 5wk 抗原50μg/只，溶于300μl 生理盐水中，腹腔注射； 加强 融合前3~5天，抗原20~30μg /只，溶于50μl 生理盐水中， 小鼠尾静脉注射以加强免疫 动物免疫 一、可溶性抗原 1wk 细胞数量8×106/只，洗涤三遍，用0.3~0.4ml的生理 盐水重悬，腹腔注射； 3wk 细胞数量6×106/只，细胞的预处理及注射的部位同上； 5wk 细胞数量5×106/只，细胞的预处理及注射的部位同上； 加强 融合前的4~5天，细胞数量3×106 /只，加强免疫 在以肿瘤细胞作免疫原时，为避免免疫过程中小鼠因生长肿瘤而死亡，故用丝裂霉素（MMC）处理免疫原细胞，抑制其生长繁殖以防形成肿瘤。最后的加