实验6细菌鉴定中常用的理化.ppt

实验六细菌鉴定中常用的理化生化反应  3)了解细菌在培养基中生长现象及其代谢产物在 鉴别细菌中的意义 2)通过细菌对不同含碳、氮化合物的分解利用情况了解细菌碳、氮代谢类型的多样性。 二、实验内容 糖（醇）类发酵实验： 1)糖发酵实验，比较大肠杆菌和变形杆菌的糖发酵结果。 2)甲基红实验，比较大肠杆菌和产气杆菌的甲基红反应结果。 3)伏-普实验（V-P实验），比较大肠杆菌和产气杆菌的V-P反应结果。 蛋白质、氨基酸及大分子物质代谢实验 1）吲哚实验，比较大肠杆菌和产气杆菌的吲哚反应结果 2）硫化氢实验，比较大肠杆菌和变形杆菌硫化氢反应结果 3）明胶液化实验，比较大肠杆菌和枯草杆菌明胶液化结果 4）淀粉水解实验，比较大肠杆菌和枯草杆菌淀粉水解结果 有机酸盐及氮盐利用实验 三、实验原理 因细菌所含的酶不同，其发酵糖（醇）后的代谢产物亦不相同，即可产酸产气，或产酸不产气。酸的产生可利用培养基中溴甲酚紫的颜色变化进行判断（pH5.2黄色—6.8紫色），即当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。 气体产生可由发酵管内倒置的杜氏小管中有无气泡来判断。 甲基红（Methyl red）实验（MR实验） 大肠杆菌等许多细菌分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸可进一步分解成甲酸（或乙酸\乳酸）,使培养基的pH降低到4.2以下,此时加入甲基红指示剂，呈现红色 。 产气杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸,培养基的pH在6.2以上, 故此时加入甲基红指示剂,呈现黄色. 靛基质(吲哚)实验 大肠杆菌等能分解蛋白质中的色氨酸,产生靛基质(吲哚),靛基质与对二甲基氨基苯甲醛结合形成玫瑰色靛基质(红色化合物). 硫化氢实验 某些细菌能分解含硫的氨基酸(胱氨酸\半胱氨酸等),产生硫化氢与培养基中的铅盐或铁盐,形成黑色沉淀硫化铅或硫化铁.为硫化氢实验 细菌不能直接利用淀粉,须经淀粉酶将淀粉水解为小分子糊精或进一步水解为葡萄糖(或麦芽糖)后被细菌吸收利用,细菌水解淀粉的过程可通过底物的变化来证明,即加碘液测定时，不再产生蓝色. 产气杆菌等能以柠檬酸钠为碳源进行生长。其分解柠檬酸盐后产生碳酸盐, 培养基呈碱性.使培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为蓝色.不能利用柠檬酸盐为碳源的细菌,在该培养基上不生长,培养基不变色.  糖发酵实验 吲哚实验 V.P实验 硫化氢反应 明胶实验 柠檬酸盐实验 四、实验仪器、材料和用具 大肠杆菌,变形杆菌,枯草杆菌,产气杆菌斜面 培养基 1)葡萄糖和乳糖发酵培养基（糖类发酵实验）. 1.编号： 在试管上标明培养基名称,所接种的菌名和组号. （二）甲基红实验(MR实验) 2.1支接种大肠杆菌，1支接种产气杆菌,1支不接种，作为对照。37℃培养48h，加甲基红指示剂数滴，观察结果。 （三）伏-普实验(V.P.实验) 取3支葡萄糖蛋白胨水培养基，1支接种大肠杆菌，1支接种产气杆菌，1支留作对照。37℃培养48 h取出,加入40% KOH 5-10滴,然后再加入等量的5%α-萘酚溶液,用力振荡,再放入37℃培养箱中保温15-30min加快反应速度.若培养物呈现红色,为伏-普反应阳性. (四）靛基质(吲哚)实验 取3支胰蛋白胨水培养基， 1支接种大肠杆菌，1支接种产气杆菌，1支留作对照。37℃培养24-48h后, 沿试管壁滴加数滴吲哚试剂于培养物液面, 观察结果.呈现玫瑰红色为阳性,不变色为阴性. 取3支营养明胶培养基，用穿刺接种方法，1支接种大肠杆菌，1支接种枯草杆菌,1支作对照。37℃培养48h后, 将明胶培养基轻轻放入4℃冰箱30 min,观察明胶的液化情况。 （七）淀粉水解实验 1.将冷却到50℃的淀粉培养基以无菌操作制成平板. 2.用接种环取少许枯草杆菌划线接种在平板的一边,再取少许大肠杆菌划线接种在平板的另一边. 3.置37℃温箱培养24h. 4.打开平皿, 将少量卢戈氏碘液滴加于平板上，轻轻摇动,使碘液均匀铺满整个平板.如菌苔有透明圈出现,表明淀粉已被水解.透明圈的大小,说明该菌水解淀粉能力的大小. （八）柠檬酸盐利用实验 取3支柠檬酸盐斜面培养基，1支接种大肠杆菌，1支接种产气杆菌，1支作对照。37℃培养24 h观察结果.培养基变深蓝色者为阳性.培养基不变色,则继续培养5-7天,培养基仍不变色者为阴性. （九）硝酸盐还原实验 取3支硝酸盐培养基，1支接种大肠杆菌，1支接种枯草杆菌，1支作对照。37℃培养18-96h,每天吸取培养物2ml加格里斯试剂A液和B液1滴,出现粉红色,玫瑰色,橙色或棕色为阳性.如无阳性反应,可加入1-2滴二苯胺试剂,如培养液