实验一_碱变性法抽提质粒DNA.ppt

梁晓红 王晓燕 山东大学医学院免疫学研究所 2011-6 医学分子生物学实验 基因克隆实验技术部分 共100分 实验设计60% 考勤+实验报告40% 实验设计（3000~4000字）： 选题：结合自己的专业，利用基因工程技术 内容：1）立题依据；2）原理；3）实验材料；4）实验方法；5）预期结果；6）参考文献（＞3篇） 评分标准：1）项目完整35分；2）创新性15分； 3）可行性5分；4）合理性5分。 注意事项 1.分组（4人/组） 2.隔离衣 3.离心机、移液器等使用 Restriction enzymes: ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 选（分） 切 接 转→筛→扩 重组DNA技术的基本过程 总体实验安排 上午 下午 1 碱变性抽提质粒DNA 核酸浓度和纯度分析 核酸电泳及分子量测定 质粒DNA的酶切 2 感受态细胞的制备 质粒DNA的酶切产物电泳 试剂盒回收DNA 目的基因与载体的连接 3 重组子筛选、鉴定方法 蓝白斑筛选 真核基因组DNA抽提1 连接子的转化 真核基因组DNA抽提2 4 菌落的PCR鉴定 PCR产物的电泳 实验一 碱变性法抽提质粒DNA 质　粒（plasmid） 质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子, 为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主的细胞质中。 质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。 质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。 存在于细菌染色体外的小的共价、闭环双链DNA分子。 （1） 质粒在细胞内的复制一般有两种类型: 严紧控制型(Strengent control)：复制受宿主细胞的严格调控，拷贝数低； 松驰控制型(Relaxed control)：复制不受宿主细胞的调控，拷贝数高, 适用于基因工程中做载体。 分离质粒DNA的方法 碱变性法； 煮沸法； SDS法； 羟基磷灰石层析法等 一、实验目的 通过本实验掌握碱变性法提取质粒DNA。 　二、实验原理 在pH 12-12.5时，线性DNA被彻底变性，但共价闭环质粒DNA虽然氢键也发生断裂，但两条互补链仍会紧密缠绕结合在一起。 当在溶液体系中加入pH4.8的NaAC时，溶液恢复中性，质粒DNA迅速复性，染色体DNA不能恢复，形成网状结构，通过离心可以把变性的染色体DNA和蛋白-SDS复合物沉淀分离出来。 质粒DNA 细菌染色体DNA 分子量小 分子量大 超螺旋 线性双螺旋 三、实验仪器、材料与试剂 （一） 仪器 1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 高压灭菌锅 4. 高速离心机 5. 微量取液器 （二） 材料 大肠杆菌JM109（pBR322-HBV） （三） 试剂 1. LB培养基 2. LA培养基（LB+Amp） HBV片段 pBR322-HBV 四、实验步骤 甘油保存的菌种JM109-PBR322-HBV,涂布于LA琼脂平板 ? 37℃，培养过夜 挑取单克隆于2ml LA液体培养基中 ? 37℃，220rpm振荡培养过夜 ? 取1.4ml菌液入1.5ml的EP管中 ? 12000rpm、离心30s，弃上清 ? 重复上述步骤一次 ? 100ul溶液I悬浮菌体（充分振荡) ? 加入200uL溶液II,颠倒混匀5次（轻柔），冰浴3～5min。 ?(出现拉丝现象) 加入150μl溶液III，温和混匀10s，冰上放置3～5min。 ?(云雾状 沉淀) 12000rpm离心5min，取上清到一新Ep管(约440μl ) ? 上清加等体积氯仿/异戊醇（24/1），颠倒混匀2min，12000 rpm离心5min。 (分离蛋白质及核酸，氯仿可使蛋白质变性，异戊醇防止发泡) ? 取上清(约400μl )至新Ep管中。 ? 加入2倍体积100%冰乙醇,混匀，室温放置5min。 ? 12000 rpm 离心5min。 ? ?(沉淀质粒DNA ) 弃上清，加入70％乙醇1ml，颠倒漂洗（保持沉淀在管底），12000 rpm离心3min。 ?(清除残余离子 ) 弃上清，将Eppendorf管于吸水纸上倒置1min，室温放置5min ? 加40μl TE（