实验二——清球蛋白盐析吴静.ppt

生物化学与分子生物学实验 实 验 十 血清蛋白的盐析及清/球比值的测定 实 验 目 的 （Experimental Objectives） 掌握盐析的原理和方法。 掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质的原理和方法。 了解血清蛋白质定量测定的临床意义。 实 验 原 理 (Experimental Principles) 蛋白质的胶体性质 蛋白质的呈色反应——考马斯亮兰染色法 蛋白质稳定亲水胶体的因素： ①水化膜；②表面电荷。 蛋白质的沉淀：蛋白质从溶液中析出。 沉淀的原因:破坏水化膜;改变蛋白质表面基团的解离. 沉淀的方法:盐析法的原理;有机溶剂法;重金属盐沉淀法;生物碱试剂和某些酸类沉淀法 正常人的血清总蛋白中清蛋白占绝大部分，约60%以上，其余为球蛋白，两者比例为1.5-2.5：1。 清蛋白在水中溶解性大于球蛋白，在血清中加入硫酸铵至半饱和时，球蛋白可被完全沉淀，而清蛋白保持溶解状态，依此可将清蛋白和球蛋白分离。 （2）双缩脲反应 血清蛋白质定量测定的临床意义 正常血清中含有多种蛋白质，其总量为6-8g/100ml。 在某些病理情况下 蛋白质浓度降低——如营养不良、肝脏疾患 蛋白质浓度增高——肾病综合症、严重脱水情况下 操 作 步 骤 （Operating Procedure） （一） 血清蛋白的盐析 取1.5 ml EP管1支+0.5 ml血清——滴加饱和硫酸铵0.5 ml，边加边混匀——室温静置5分钟后，10000rpm，离心2分钟——转移上清至另一支EP管内备用，此为盐析上清。 （二）血清蛋白含量测定 1.标准曲线制作 （1）蛋白标准液的倍比稀释： （2）标准曲线的制作 2.血清中蛋白质浓度的测定 （1）血清样品的稀释：取2支1.5 ml EP管，标记1’、2’号，按下表稀释. （2）盐析上清（清蛋白）的稀释：取2支1.5 ml EP管，标记1’’、2’’号，按下表稀释 （3）血清中蛋白质浓度的测定：取2支大试管，标记5、6号，按下表加入试剂。 （三）绘制标准曲线，计算血清蛋白浓度、清蛋白浓度及清/球比值。 血清蛋白（总蛋白）浓度 = 图示值×200（稀释倍数）= （mg/ml） 盐析上清（清蛋白）浓度 = 图示值×200（稀释倍数）= （mg/ml） 计算清/球比值: 清蛋白的浓度:总蛋白的浓度-清蛋白的浓度）= 思考题(Questions) 蛋白质分离纯化的方法 * * 蛋白质的呈色反应 （1）Bradford显色法 考马斯亮蓝G250（Coomassie brilliant blue）与蛋白质中的碱性氨基酸和芳香族氨基酸残基结合，使溶液呈蓝色。此时蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。此法灵敏度比酚试剂法高4倍，常用于快速定量分析。 考马斯亮蓝G-250 （3）酚试剂呈色反应（Lowry法） 400μl 4#200μl 3#200μl 2#200μl 标准蛋白溶液（1mg/1ml） 200μl 200μl 200μl 0.9% NaCl 4 3 2 1 管 号 4 3 2 1 0 管 号 A595nm 100 50 25 12.5 0 蛋白质终浓度（μg） 100μl 100μl 100μl 100μl 对应加入倍比稀释的 蛋白标准液 100μl 0.9% NaCl 3ml 3ml 3ml 3ml 3ml 考马斯亮蓝 G-250 将溶液充分混合，放置2min后开始测吸光度A595nm. 1’ 20μl 20μl 血 清 380μl 180μl 0.9% NaCl 2’ 1’ 管 号 1’’ 20μl 20μl 血 清 180μl 180μl 0.9% NaCl 2’’ 1’’ 管 号 A595nm 蛋白质含量（μg） 100μl 稀释盐析上清 （2’’号管） 100μl 稀释血清 （2’号管） 3ml 3ml 考马斯亮蓝G-250） 6 5 管 号 取样后充分混合，放置2min后,记录A595nm，并通过标准曲线查得待测样品中蛋白质含量X（μg）。 *