实验二 PCR引物设计.ppt

PCR 引物 设计;实验内容;PCR反应一般由三个步骤组成：① 模板的热变性；② 引物复性到单链模板上；③ 热稳定DNA聚合酶催化的延伸;一、引物设计要点;2. 引物长度： 引物中与模板互补的区应为18-27个核苷酸长度； 上下引物长度差别不能大于3bp，如上游引物为19bp，下游引物为24bp等。 ;3. 解链温度（Tm 值）： 引物的 Tm 值一般为50-70℃； 计算出来的两个引物的 Tm 值相差不能大于5 ℃； 扩增产物的 Tm 值与引物的 Tm 值相差不能大于10 ℃； 这些特性保证了扩增产物在每一个 PCR 循环可有效变性。;4. 重复或自身互补序列： 形成发夹结构，会阻止引物和模板之间的复性。;5. 上下引物的互补性： 一个引物的3末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上，因为PCR中引物浓度较高，会形成引物二聚体。 ;6. 3’末端 3’末端的性质非常关键。 不推荐3’末端有….NNNCG或…..NNNGC序列的引物，GC高自由能促进发夹及引物二聚体产生； 5’端序列添加限制性酶切位点。 ;二、Primer Premier 软件设计引物;正向（As is）、反向（reversed）、互补（complemented）及反向互补（reverse complemented ）。;Primer;点击 Search，进行引物有哪些信誉好的足球投注网站;Search criteria 窗口：多种参数可以调整。;Manual→Search parameters →人工有哪些信誉好的足球投注网站参数设置窗口。;Search progress 窗口中显示Search Completed→OK键;结果窗口→有三种显示形式，上游引物、下游引物和成对显示。引物按优劣次序排列，满分为100。选其中的一对引物，在主窗口显示结果。;该图分为四部分：最上面是图示模板及产物位置，“S”和“A”可查看有义链或反义链的引物。右边是两个引物在模板上结合位置的直观图；第二层是模板及引物序列的配对情况；第三层显示引物的各种参数。注意：尾末给出该引物的最佳退火温度！！第四层：四种重要指标的分析 ;Ta：复性温度（退火温度），至关重要！！！ 退火温度太高，引物不能与模板很好地复性，扩增效率会非常低； 退火温度太低，引物将产生非特异性复性，从而导致非特异性DNA片段的扩增； 退火温度，通常比理论设计的引物和模板的Tm值低 3-5 ℃下进行。 最好通过对复性温度比两条引物的Tm 值低 2-10 ℃内进行PCR预实??（梯度）来对复性条件的优化。;引物长度：控制着引物的特异性和在PCR反应中的退火温度。长的PCR引物能给扩增带来更好的特异性，可以通过降低退火温度提高反应的灵敏度，不过长引物易形成包括发夹结构二聚体自身互补等二级结构。适宜引物长度为18-27 nt。 ;三、ncbi 在线 primer-Blast 获取候选引物;;或者;至于RT-PCR所用的引物，最好是使得产物跨过内含子，这样避免潜在DNA对RT-PCR的干扰。 ;;;筛选时，上、下游引物不在同一个外显子上的引物对。 ;四、引物对的特异性验证：BLAST 验证引物 ;http: ///BLAST/ 点击Basic BLAST中的 nucleotide blast 选项 ;在Enter Query Sequence栏中输入引物序列： 例：mouse Bad基因上游引物为5’-GGGCAGCCACCAACAGTCATCAT-3’ ;选该物种基因组和转录物作为有哪些信誉好的足球投注网站的范围;引物长度为23nt，每条横线表明该匹配序列在引物上的位置。;与引物匹配的序列有两类：转录物和基因组序列。在通过RT-PCR时由于提取RNA的时候基因组DNA可以被完全去除，基因组DNA上潜在的引物匹配序列不会对扩增目的基因造成影响，因此只有位于转录物上的匹配序列才有可能对PCR产物产生不利影响。 ;目的基因;如果其他基因序列与上游引物的3’端有匹配，此时查看与下游引物的3’端的匹配情况，如果不匹配的话，不影响目的基因扩增结果。;分析结果表明，这对引物虽在其他基因序列上有不同程度的错配，但是他们对mBad 基因扩增不会产生不利影响，属于特异性较好的引物对。;在Enter Query Sequence栏中输入引物序列： 例：引物为5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’; 5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’ 同时输入上下游引物。输入上下游引物都从5’ → 3’。输入上游引物后，加上≥20个字母n，再输入下游引物。;在Choose Search Set栏中：Database根据预操作基因的种属定了，可选Human genomic + transcript或Others;在Program