实验四 核酸的鉴定.ppt

实 验 二 DNA琼脂糖凝胶电泳 一、实验目的： 1、掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理和方法。 2、学习核酸染色的方法。 二、实验原理: （一）电泳技术： 1、电泳定义：是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。 根据电泳支持介质的不同，可分为滤纸，醋酸纤维薄膜，淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。电泳技术的应用非常广泛，从分离小分子如氨基酸、肽、激素、核苷酸到复杂的大分子如蛋白质、核酸甚至病毒颗粒的分离鉴定都依赖于电泳技术。 （1）带电颗粒的大小和形状：颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快； （2）颗粒的电荷数：电荷越少，电泳速度越慢，反之越快； （3） 溶液的粘度：粘度越大，电泳速度越慢，反之越快； （4）溶液的pH值：影响被分离物质的解离度，离等电点越近，电泳速度越慢，反之越快； 　　（二）琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理： DNAgreen核酸染料 DNAgreen是一种花箐类染料，具有安全、灵敏作为各种核酸电泳的染色剂。 DNAgreen最大吸收峰在510nm左右，另外在254-380nm还有一个吸收峰，与核酸结合后发射绿色荧光，因此在紫外凝胶透射仪上可以检测出DNA样品。 作为EB的一种替代品。 （1）核酸大小与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 凝胶中，DNA片段迁移率与DNA分子大小成反比(≤ 20kb) ，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。 （2）核酸构象与琼脂糖凝胶电泳分离的关系????不同构型DNA的移动速度次序为：闭环DNA直线DNA开环的双链环状DNA(当琼脂糖浓度太高时，环状DNA不能进入胶中)。 （3）不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖浓度/%??? 0.3?? ? ?0.6?? ?0.7?? 0.9???? 1.2?? ?1.5??? ?2.0线状DNA大小/kb? ?60-5 ?20-1? 10-0.8 ?7-0.5? ?6-0.4? 3-0.2?? 2-0.1注：DNA片段在5-500bp之间时，一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行电泳分离。 三、实验材料、仪器和试剂： 1、实验材料：提取的小麦苗中的DNA 2、仪器： (1)稳压稳流电泳仪 (2)可调微量移液器 (3)水平电泳槽 （4）暗箱紫外透射仪等。 3、试剂： （1）电泳缓冲液：Tris-硼酸－EDTA（50×TBE）pH8.3。 （2）加样缓冲液：0.25%溴酚蓝（BPB），40%蔗糖，DNAgreen。 (4)琼脂糖凝胶：浓度为0.7%。 1、凝胶板的制备： （1）取琼脂糖0.7 g，加1×TBE缓冲溶液100ml，于沸水浴中至熔化，制成0.7%的琼脂糖胶液。 （2）胶床两头贴上防水胶带，形成8mm高的挡墙，压紧胶带，置水平台面上。 （3）插入梳子，梳齿下端离板底0.5－1mm。 （4）当琼脂糖胶液温度降到60℃的时候,将60℃凝胶不间断倒入胶床，高3－4mm，避免产生气泡，室温下凝固。 （5）完全凝固后，撕掉胶带，置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，高于胶面1－2mm，从一头轻轻斜拉 梳子，除去产生的气泡。 3、加样： 将样品DNA溶液与加样缓冲液以5 ：1的体积比混合，用微量进样器加样，每加完一个样品，冲洗三次。加样量15～20 ?l （加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部）。 4、电泳： 为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm（两电极间的距离）开始时用较高电压(80V)，样品一进入胶内则将电压调至5V/cm 。当染料前沿移至底边1-2mm时，电泳毕。 5、染色、观察、显微照相与记录： 关闭电源，取出胶床，浸入0.5μg/mL的EB溶液中，30min后取出。在紫外检测仪下观察凝胶中的DNA（红橙色荧光），并进行显微照相。最后要求绘制DNA电泳图谱。 * 荧光染料EB染色的原理和优点是什么？ 1、原理： EB：即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲锭溴盐(Ethidium Bromide)。 EB是一种扁平分子，它可以嵌入核酸相邻的碱基之间，在紫外线激发下，发出红橙色荧光。它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性。 溴化乙锭嵌入碱基分子中，导致DNA在复制过程中错配 。 所以溴化乙锭是一种强诱变剂，具有高致癌性。在实验过程一定要带上手套