实验质粒提取.ppt

质粒DNA的提取 目的 ： 学习和掌握SDS-碱裂解法提取质粒 质粒（Plasmid) 质粒是指在细菌染色体外，能自主复制和遗传的DNA分子，大多数是双链、闭合的超螺旋环形结构。 自然界的质粒通常含有编码一些对宿主细胞有利的酶的基因，可以赋予宿主原先没有的性质，如抗生素抗性、产生一些化合物、细胞形态改变等。 “超级细菌”大多数都是通过质粒获得抗生素抗性。 参与细菌有性生殖的F因子，实际也是一种质粒，可以使细菌产生性菌毛并转移F因子。 经过改造的质粒可用于DNA重组技术，通常具有抗生素和其他筛选标记、多克隆位点等。 质粒在基因工程中的应用 分 切 接 转 筛 表 通过含葡萄糖、密度较高的溶液重悬携带质粒的细菌 NaOH和十二烷基硫酸钠（SDS），共同作用裂解细胞 NaOH为强碱，可使细胞膜的磷脂双分子层破裂，并能使DNA双链解链变性 SDS为表面活性剂，可溶解细胞膜上的脂类使之破裂，并可通过疏水作用使蛋白质变性 原理 pH4.8的乙酸-乙酸钾缓冲液中的乙酸可中和NaOH，钾盐可与十二烷基硫酸钠反应生成不溶的十二烷基硫酸钾（PDS）沉淀 NaOH被中和后，较小的质粒DNA可迅速复性，而基因组DNA则容易在分子间部分复性形成网状结构 SDS通过疏水作用和蛋白质结合，加入钾盐生成PDS沉淀可使蛋白质被共沉淀去除 一些蛋白质可能仍与基因组DNA相互作用，将蛋白沉淀同时，可去除基因组DNA 酚抽提可进一步去除蛋白质。 乙醇可沉淀核酸，70%乙醇洗涤可去除盐分 RNA酶可去除残留RNA 经过上述步骤纯化即可得到质粒DNA 实验步骤 1. 收集细菌：1.5ml 细菌，离心 10000rpm, 2min 2. 吸取培养液将细胞沉淀尽可能干燥 3. 加 100μL 溶液 I, 充分悬浮 原理 葡萄糖：增加粘度，防止菌体沉淀 Tris：缓冲作用，稳定pH EDTA： 鳌合金属离子，抑制DNase，防止DNA降解 4. 加200μL 溶液II （新鲜配制）, 温和混匀（要少于5min）。 SDS： 是离子型表面活性剂，溶解细胞膜上的脂类，使之破裂 使蛋白质变性 NaOH（pH12.6）：破碎细胞膜，使核酸变性 注意：此试剂现配现用，冬季应注意是否有结晶，否则加热使之融化，溶液变清澈 5. 加入150μL 溶液III （冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。 6. 10000rpm离心5min，取上清，注意不要取到沉淀。 原理： HAc：中和复性，使质粒DNA复性，但基因组DNA则容易在分子间部分复性形成网状结构 K＋与SDS、蛋白质和膜形成溶解度小的沉淀 7. 酚抽提 将上清中加入酚：氯仿（1:1），反复振荡混匀 10000rpm，离心5min 取上清 注意不要取到酚相；剩余的酚应盖好盖后丢弃，防止环境污染 原理：酚使蛋白质变性，溶解度下降，通过离心去除。 注意： 酚为TE或Tris饱和酚。 酚有腐蚀性，操作需带手套 酚与氯仿：异戊醇上均覆盖了一层水相（为防止挥发和氧化），取液时应注意取下层的试剂。 8. 乙醇沉淀 加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5-10 min。 10000rpm，离心5min。弃上清，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 原理 乙醇可去除DNA的水化膜，使之沉淀。 9. 用1mL 70％离心乙醇洗涤质粒DNA沉淀，震荡并离心，弃上清，晾干。 10. 加入50μL TE缓冲液，其中含有20μg/mL的胰RNA酶，使DNA完全溶解，-20℃保存。 目的：去除盐分 目的：去除剩余的小分子RNA 注意事项 加入溶液I后菌体需充分悬浮。 加入溶液II后不可剧烈振荡，时间不可过长，否则可能会造成基因组DNA不能充分去除。 加入溶液III后混匀需将沉淀重复分散，但也不可过分剧烈。 酚有腐蚀性，操作时需带手套。 酚抽提后吸取水相上清时要避免将酚相吸入，否则会造成蛋白质去除不完全、影响乙醇沉淀以及质粒中酚的残留。 乙醇沉淀步骤需充分混匀。 * 左下角图标处有超级链接到二 重组DNA技术 * 左下角图标处有超级链接到二 重组DNA技术