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实验质粒提取
质粒DNA的提取 目的 : 学习和掌握SDS-碱裂解法提取质粒 质粒(Plasmid) 质粒是指在细菌染色体外,能自主复制和遗传的DNA分子,大多数是双链、闭合的超螺旋环形结构。 自然界的质粒通常含有编码一些对宿主细胞有利的酶的基因,可以赋予宿主原先没有的性质,如抗生素抗性、产生一些化合物、细胞形态改变等。 “超级细菌”大多数都是通过质粒获得抗生素抗性。 参与细菌有性生殖的F因子,实际也是一种质粒,可以使细菌产生性菌毛并转移F因子。 经过改造的质粒可用于DNA重组技术,通常具有抗生素和其他筛选标记、多克隆位点等。 质粒在基因工程中的应用 分 切 接 转 筛 表 通过含葡萄糖、密度较高的溶液重悬携带质粒的细菌 NaOH和十二烷基硫酸钠(SDS),共同作用裂解细胞 NaOH为强碱,可使细胞膜的磷脂双分子层破裂,并能使DNA双链解链变性 SDS为表面活性剂,可溶解细胞膜上的脂类使之破裂,并可通过疏水作用使蛋白质变性 原理 pH4.8的乙酸-乙酸钾缓冲液中的乙酸可中和NaOH,钾盐可与十二烷基硫酸钠反应生成不溶的十二烷基硫酸钾(PDS)沉淀 NaOH被中和后,较小的质粒DNA可迅速复性,而基因组DNA则容易在分子间部分复性形成网状结构 SDS通过疏水作用和蛋白质结合,加入钾盐生成PDS沉淀可使蛋白质被共沉淀去除 一些蛋白质可能仍与基因组DNA相互作用,将蛋白沉淀同时,可去除基因组DNA 酚抽提可进一步去除蛋白质。 乙醇可沉淀核酸,70%乙醇洗涤可去除盐分 RNA酶可去除残留RNA 经过上述步骤纯化即可得到质粒DNA 实验步骤 1. 收集细菌:1.5ml 细菌,离心 10000rpm, 2min 2. 吸取培养液将细胞沉淀尽可能干燥 3. 加 100μL 溶液 I, 充分悬浮 原理 葡萄糖:增加粘度,防止菌体沉淀 Tris:缓冲作用,稳定pH EDTA: 鳌合金属离子,抑制DNase,防止DNA降解 4. 加200μL 溶液II (新鲜配制), 温和混匀(要少于5min)。 SDS: 是离子型表面活性剂,溶解细胞膜上的脂类,使之破裂 使蛋白质变性 NaOH(pH12.6):破碎细胞膜,使核酸变性 注意:此试剂现配现用,冬季应注意是否有结晶,否则加热使之融化,溶液变清澈 5. 加入150μL 溶液III (冰上预冷),盖紧管口,颠倒数次使混匀。 6. 10000rpm离心5min,取上清,注意不要取到沉淀。 原理: HAc:中和复性,使质粒DNA复性,但基因组DNA则容易在分子间部分复性形成网状结构 K+与SDS、蛋白质和膜形成溶解度小的沉淀 7. 酚抽提 将上清中加入酚:氯仿(1:1),反复振荡混匀 10000rpm,离心5min 取上清 注意不要取到酚相;剩余的酚应盖好盖后丢弃,防止环境污染 原理:酚使蛋白质变性,溶解度下降,通过离心去除。 注意: 酚为TE或Tris饱和酚。 酚有腐蚀性,操作需带手套 酚与氯仿:异戊醇上均覆盖了一层水相(为防止挥发和氧化),取液时应注意取下层的试剂。 8. 乙醇沉淀 加入2倍体积无水乙醇,混匀后,室温放置5-10 min。 10000rpm,离心5min。弃上清,把离心管倒扣在吸水纸上,吸干液体。 原理 乙醇可去除DNA的水化膜,使之沉淀。 9. 用1mL 70%离心乙醇洗涤质粒DNA沉淀,震荡并离心,弃上清,晾干。 10. 加入50μL TE缓冲液,其中含有20μg/mL的胰RNA酶,使DNA完全溶解,-20℃保存。 目的:去除盐分 目的:去除剩余的小分子RNA 注意事项 加入溶液I后菌体需充分悬浮。 加入溶液II后不可剧烈振荡,时间不可过长,否则可能会造成基因组DNA不能充分去除。 加入溶液III后混匀需将沉淀重复分散,但也不可过分剧烈。 酚有腐蚀性,操作时需带手套。 酚抽提后吸取水相上清时要避免将酚相吸入,否则会造成蛋白质去除不完全、影响乙醇沉淀以及质粒中酚的残留。 乙醇沉淀步骤需充分混匀。 * 左下角图标处有超级链接到二 重组DNA技术 * 左下角图标处有超级链接到二 重组DNA技术
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