工分1211 第二组 高效液相色谱知识.ppt

高效液相色谱理论知识;;目录;高效液相色谱法;1 高效液相色谱仪; （2）高压输液泵 高压输液泵功能是将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。液相色谱为了获得高柱效，所用色谱柱径较细，所填固定相粒度很小，因此，对流动相的阻力较大，为了使流动相能较快流过色谱柱，就需要高压输液泵。 （3）过滤器 除掉机械杂质及固体颗粒。 由于液相色谱柱、进样器等都很精密，微小的机械杂质将导致这些部件的损害，而不能正常工作，同时机械杂质在柱头的积累还影响柱子的使用，因此，溶剂需要过滤。;; 1.1.2 进样系统 进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，它的作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～40 cm），因此柱外效应较突出。柱外效应是指色??柱外因素引起的峰展宽，包括进样系统，连接管，检测器中存在的死体积。柱外展宽可分为柱前和柱后展宽，进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。 ; 常用的进样器有以下二种： （1）六通阀进样器 目前液相色谱仪所采用的手动进样器几乎都是耐高压、重复性好和操作方便的阀进样器。六通阀进样器是最常用的，进样体积有定量管确定，常规高效液相色谱仪中通常使用的是10μL、20μL体积的定量管。 （2）自动进样器 自动进样器是由计算机自动控制定量阀，按预先编制的注射样品操作程序进行工作。 ; （2）HPIC检测器的分类 HPLC检测器一般分为两类，通用性检测器和专用型检测器。 通用性检测器可连续测量色谱柱流出物（包括流动相和样品组分）的全部特性变化，通常采用差分测量法。这类检测器包括折光指数检测器、电导检测器和蒸发光散射检测器等。 专用型检测器用以测量被分离样品组分某种特性的变化，这类检测器对样品中组分的某种物理或化学性质敏感，而这一性质是流动相所不具备的，或至少在操作条件下不显示。这类检测器包括紫外检测器、荧光检测器、安培检测器的等。; 1.1.3 分离系统 分离系统包括色谱柱、恒温器和保护柱等部件。进行色谱分离的首要工作是选择性能良好的色谱柱，即选择在确定的分离条件下分离效率高和分析时间短的色谱柱。 色谱柱的选择应考虑：固定相类型的选择, 主要取决于样品分离模式；柱填料的结构, 主要指颗粒的形状大小、均匀性、比表面、平均孔径和孔容等；柱规格指柱内径、柱长度和填料粒度；色谱柱的牌号/厂商。;1.1.4 检测系统 （1）HPIC检测器的要求 理想的HPIC检测器应满足下列要求：第一、具有高灵敏度和可预测的响应；第二、对样品所有组分都有响应，或具有可预测的特异性，适用范围广；第三、温度和流动相流速的变化对响应没有影响；第四、响应与流动相的组成无关，可作梯度洗脱；第五、死体积小，不造成柱外谱带扩展；第六、使用方便、可靠、耐用，易清洗和检修；第七、响应值随样品组分量的增加而线性增加，线性范围宽；第八、不破坏样品组分；第九、能对被检测的峰提供定性和定量信息；第十、响应时间足够快。 ; 1.2 仪器的操作流程;7)．设计走样方法。点击file，选取select users and methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。 8).进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。 9)．关机时，先关计算机，再关液相色谱。 10)．填写登记本，由负责人签字。 ;2 思考与练习; 去除硬结部分(污染的填料），装入新填料，滴一滴甲醇，填料下陷，再填，用与柱内径相同的顶端平滑的不锈钢杆压紧，再填平，滴甲醇，再压紧反复几次，直至装满填平；。柱头用甲醇冲洗干净，擦净柱外壁的填料，拧紧柱头，用纯甲醇冲洗30 分钟以上。 (3）峰面积重复性不佳。 答：原因⑴进样阀漏液； ⑵加样针不到位。 处理对于第一种情况更换进样阀垫圈； 对于第二种情况保证加样针插到底，注射样品溶液后须快速、平稳地从LOAD 状态转换到INJ EC T 状态，以保证进样量的准确。日常工作中，液相色谱仪的保