FISH及其在临床病理诊断中的应用.ppt

荧光原位杂交技术及其在临床病理诊断中的应用 简介 分子病理诊断与个体化治疗 常用分子遗传学检测方法 简介 FISH = Fluorescence In Situ Hybridization 利用荧光标记的DNA探针检测组织或细胞内与其互补的DNA片段 应用：遗传病 血液肿瘤 实体瘤 样本：羊水、绒毛、流产组织、外周血、骨髓、体液及各种肿瘤组织等 FISH技术的基本原理 FISH技术的基本原理 探针标记的方法 直接法 FISH技术的分类 FISH技术的分类 FISH技术的分类 探针的种类： FISH技术的分类 按检测目的分类： Numeration FISH：检测基因扩增或染色体的拷贝数 FISH技术的分类 按检测目的分类： Deletion FISH：检测基因缺失 FISH技术的分类 按检测目的分类： Translocation and fusion FISH：检测基因异位和融合 FISH技术的分类 按检测目的分类： Break apart FISH：检测基因断裂 FISH技术的分类 按检测目的分类： M-FISH：检测多种染色体异常 red: chromosome 3 gold: chromosome 9 green:chromosome 7 aqua: chromosome 17 FISH基本流程——预处理 石蜡切片 切片3-5μm，涂胶片，65℃烘烤过夜 脱蜡至水，去离子水低渗处理 蛋白酶K消化 甲醛固定，梯度乙醇脱水 FISH基本流程——预处理 细胞学样本 离心收集细胞，胶原酶消化 去离子水低渗处理 预固定，调整悬液浓度滴片 65℃烘烤过夜 HCl处理及胃酶消化 甲醛固定，梯度乙醇脱水 FISH基本流程——杂交 荧光DNA探针及样本DNA变性 手工：探针与样本分别变性 杂交仪：探针与样本共变性 杂交（4-24hour） 杂交后洗涤 DAPI复染 荧光显微镜观察、结果分析 FISH结果判断 细胞学 选择轮廓清晰无重叠的细胞，计数每个胞核中的不同荧光信号的数量 阳性细胞比例对照阈值判断结果 FISH结果判断 非特异背景 FISH在临床病理诊断中的应用 肿瘤的早期诊断与鉴别诊断 肿瘤的分类 肿瘤预后判断 肿瘤复发监测 肿瘤的个体化治疗 1.在尿细胞学诊断中的应用 尿路上皮癌的诊断及随访： 膀胱镜：有创、痛苦、难以诊断肉眼见不到的肿瘤 尿脱落细胞：特异性高、敏感性低 肿瘤标志物：炎症干扰、假阳性 FISH：有效提高检出率 早期诊断 检测复发 1.在尿细胞学诊断中的应用 9号染色体 3号染色体 7号染色体 17号染色体 早期诊断 敏感性为71%，常规尿脱落细胞学检查26%和BTA检测。 敏感性和特异性不受膀胱内灌注化疗、感染、血尿等因素的影响 检出率随肿瘤分级的增高而增加 监测复发： 膀胱镜检查未发现病变而FISH检测阳性的患者中，50％～80%在未来的29个月内发生肿瘤复发 预测复发的敏感性为86% 1.在尿细胞学诊断中的应用 我们的工作： 上尿路肿瘤传统方法检出率低，活检困难，难以在术前得到准确诊断 选择性上尿路冲洗液M-FISH检测对传统细胞学难以确定良恶性的病例是有效的辅助诊断方法 2.在宫颈细胞学诊断中的应用 宫颈癌筛查方法： 宫颈细胞涂片形态检查 敏感性55%-80%，特异性90% HPV病毒检测 敏感性84%-100%，特异性64%-95% 许多病人在一年之内可以转阴 2.在宫颈细胞学诊断中的应用 端粒酶TERC： 3q26.3 抑制凋亡、导致肿瘤发生 宫颈细胞由非典型增生向宫颈癌转变的过程中几乎都伴有端粒酶基因扩增 准确区分宫颈高度病变与低度病变 预测52%-96%的癌前病变有恶变可能 2.在宫颈细胞学诊断中的应用 Heselmeyer等的系列研究： 2.在宫颈细胞学诊断中的应用 我们的工作： TERC基因扩增率与细胞学等级和组织学等级成正相关 TERC-FISH检出高度以上病变的敏感性为77.3 %，特异性为82.4% 出现高倍扩增亦提示高级别以上病变。 3. 肺癌细胞学诊断及靶向治疗 痰、支刷、灌洗液等是肺癌诊断的有效方法，特异性强但敏感性低 LAVysion：肺癌的M-FISH检测 包含5p15、7p12(EGFR)、8q24(C-MYC)