《检验仪器学》FCM原理及临床应用.ppt

流式细胞术的基本原理及临床应用 广东医学院分析中心 蔡康荣 流式细胞术的基本概念 流式细胞术 (Flow cytometry, FCM) 是集计算机技术、激光技术、电子技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学等多门高新技术为一体的现代细胞分析技术。它是通过流动的细胞悬液测定细胞性质。它以流式细胞仪 (Flow cytometer) 为工具，在单细胞水平上对大量细胞进行高速(每秒计数1000~10000个细胞）、准确、多参数的定量或分选（纯度可达99%以上），已成为现代细胞学研究中最先进的分析技术。 血液/骨髓/单个细胞标本 + 荧光素标记McAb/荧光染料 通过气体的压力 进入流动室 在鞘液的约束下 细胞排成单列由流动室喷出 成为细胞液柱 测量区 （与入射的激光束垂直交点为测量区） 细胞被激光照射产生光散射和荧光 在与入射光束和液柱垂直的方向 放置光学系统 （透镜、光阑、滤光片、检测器） 收集信号经加工处理储存于计算机 计算机分析处理，结果分析 流式细胞仪的基本结构 1.光学系统: 光源（ 汞灯、激光） 2.液流系统: 喷嘴、流动室 3.电子系统: 检测器（散射光、荧光检测器） 4.细胞信处理: 计算机 5.细胞分选器: FACSCalibur流式细胞仪的光学系统 Flow Cell 流式细胞术分析参数 细胞在流动中通过流式细胞仪测量区时，经激光照射，细胞向空间360度立体角的所有方向散射光线，光散射的强弱与细胞的大小、形状、质膜、内部结构等有关。 对细胞分析有重要意义的是： 前向角散射（forward scatter; FSC）侧向角散射（side scatter; SSC） Forward Angle Light Scatter（前向角散射） 前向角散射（FSC） 当激光照射时，在FSC（与入射激光方向相同，接近0度） 测定的细胞衍射光强度。 与检测时样本中细胞的体积大小呈正相关。 90 Degree Light Scatter（侧向角散射） 侧向角散射（SSC） 当激光照射时，在SSC（与入射激光方向接近90度） 测定的光散射强度。 与检测时样本中细胞的细胞膜、细胞浆、核膜的折射率 有关。 用于检测细胞内部结构 如:胞浆内颗粒多少, 核质比 。 Fluorescence Detectors（荧光检测） 荧光参数 当检测细胞表面抗原分子时，结合了标记荧光素McAb的细胞经激光照射，荧光素分子吸收激光能量后，一部分以分子震动或热能消耗，一部分则 产生荧光，不同的荧光色素发射的荧光波长不同。 荧光强度的大小与结合在细胞上荧光素分子数量成比例关系。 荧光素 激发光谱 发射光谱 FITC 异硫氰基 488 525 R-PE（PE）藻红蛋白 488 575 ECD 488 615 PE-Cy5（CyChrome）488 667 PC7 635 767 流式细胞术结果分析 根据分析目的不同，对制备好的样本在流式细胞仪上测量其光散射和荧光强度。每个细胞的光散射及荧光测量数据一般以列表或矩阵方式储存于计算机中，然后进行数据的显示图象分析和结果统计处理，最终获得所分析细胞的信息。 FCM数据常以直方图、散点图、密度图、等高图、假三维图、三维图等显示 直 方 图 单参数直方图 结果清晰，容易解释。 横坐标为荧光或光散射强度的相对值，单位是道数。道数与荧光强度之间可以是线性或对数关系；纵坐标表示细胞出现的频率，即相对细胞数。 每个峰表示某些性质相同的一群细胞，用“标尺”把各峰分成区间，可统计分析出各个区间中具有相同性质细胞的多少，占总收获细胞的百分比及光散射或荧光强度的峰值、平均值、标准差、变异系数等结果。 用于定性和定量。 只能表明一个参数与细胞数量之间的关系，不能显示两个独立参数与细胞的关系。 T淋巴细胞直方图 FSC vs SSC 散点图 散点图/密度图 假三维图/等高图 假三维图 在FSC、SSC、FLI、FL2、FL3中任选两个参数为X、Y轴，再以相对细胞数为Z轴，构成三维图，由于Z轴为细胞数，为非测量参数，实际仍是二维图，故称假三维图。 假三维图对细胞群体观察更为直观 等高图