再生医学与人工肝脏.ppt

建立了大鼠、猪、猴和人等不同肝细胞的分离方法 建立了多种不同动物肝细胞的分离方法：正常人肝细胞(A)、猴肝细胞(B)和猪肝细胞(C)，大鼠肝细胞(D)。并建立了小鼠肝大部切除法所致的急性肝衰竭与肝细胞移植模型(E)。 * Established four immortalized hepatocyte lines. Using the Alginate/ chitosan to encapsulate immortalized cell with spinner culture. Hepatocytes can be amplified to 30-50 folds. * 李君 博士、副教授　 传染病诊治国家重点实验室 浙江大学医学院附属第一医院 再生医学与人工肝脏 背景 肝脏再生医学的难点 再生医学作为一门多学科交叉领域的新学科和新技术 组织工程学、材料科学、生物物理学、生物化学、工程学、临床医学等，是临床医学治疗领域的一次革命。 肝脏再生医学 干细胞和具有生物活性的仿生材料为基础， 组织工程学技术 肝脏再生医学 最终——修复病损肝组织、从而为各种原因所至的终末期肝病提供新的治疗方案和手段。 目前肝脏再生医学的研究焦点 肝干细胞的分布 生物人工肝用肝细胞源的基本要求 肝细胞基本功能: 解毒(如细胞色素P450等)和生物转化(尿素合成与氨的清除等) 肝细胞第二功能: ALB合成、糖异生、脂肪酸/氨基酸代谢 、凝血因子合成等功能 无菌、无病原；大约人体10% 肝细胞总量 (1.5X1010细胞) 增殖能力低（＜30%原代肝细胞） 新鲜分离的原代肝细胞需要纯化 冻存后复苏的原代肝细胞大多无活性与生物学功能 肝细胞培养的高成本 原代肝细胞的缺点 原代人肝细胞 理想细胞源 来源受限、体外难以增殖 低分化能力、免疫排斥, 恶性肿瘤或感染性疾病的传播 猪肝细胞 来源不限，可大量获取，与人肝细胞类似的功能 免疫原性, 病毒的转移 (PERV)、生物相容性问题 人血浆对猪肝细胞的损伤 肿瘤源性肝细胞系 可以无限增殖 培养与冻存方法简便 C3A、HepG2、HepLL等已应用于生物人工肝研究 较低的肝细胞功能（猪肝细胞） (如氨的清除与P450的活性) 潜在的致瘤性、自发的基因突变、或基因表达的改变 较高的成本 (目前常规培养方法治疗一次的细胞量需要1个月才能达到) 干细胞 全能干细胞--胚胎干细胞 伦理学问题与致瘤性问题 目前仍处于研究阶段 多能干细胞(骨髓、脐血干细胞) 数量少、达到应用目的的细胞数量需时长 成体肝干细胞 (oval cells) –可分化成肝细胞和胆管上皮细胞 分化时间短、有较强的增殖能力 来源受限、细胞量少 iPS 未来肝细胞源的选择 安全可靠的可逆性人源性永生化肝细胞系 干细胞来源 肝内干细胞 成体肝干细胞 胚胎肝干细胞 肝外干细胞 骨髓间质干细胞 脐血干细胞 胚胎干细胞 iPS细胞 生物反应器的研究进展 平 板 型 编织结构型 中空纤维型生物反应器 未来肝脏再生医学的模式 J. Cell. Mol. Med. Vol 11, No 2, 2007 植入式再生工程肝 体外人工肝脏生产技术 1995年人类组织工程学上的一大进步（鼠背上的耳朵） 兔耳朵上的人耳 人类用组织工程学方法培养成功的第一个完整器官 人造血管 人造血液 人工膀胱 人造皮肤 肝脏再生医学的发展趋势 有活性的生物材料 仿生结构 具有理想反应器的 生物人工肝 细胞再生 治疗病人 生物人工肝用细胞源研究 HepLi4肝细胞中的SV40 LT可有效切除，达到永生化肝细胞的可逆性控制 HepLi4肝细胞的特性：具有表达白蛋白、肝细胞色素P450等特性 HepLi4肝细胞的生物功能：具有氨清除、利多卡因代谢等生物转化功能 人源性永生化肝细胞系HepLL 可逆性人人源性永生化肝细胞系HepLi4 HepLi4 肝细胞表达ALB、GST等肝细胞的生物学特性 HepLi4 表达肝细胞的细胞色素P450 HepLi4 肝细胞在相差显微镜下的形态（40倍） 我们的研究 利用HepLL细胞进行BALB/C裸鼠脾内移植 免疫组化和糖原染色结果：HepLL细胞移植至肝大部切除的BALB/C裸鼠脾内，发现HepLL细胞不但能在裸鼠体内增殖，且能表达Alb、合成糖原等人肝细胞特异性功能。 移植HepLL细胞参与和促进了部分肝切除裸鼠的肝脏再生 HEP Glycogen AFP Ki67 ALB 肝衰竭病人血浆对体外培养HepLL细胞的影响 将永生化人肝细胞（HepLL）培养于100% 浓度的肝衰竭患者血浆中， 48小时细胞间连接疏松，胞浆内脂肪颗粒和溶酶体增多；细胞的氨清除等生物转化功能明显下降。 结论：肝衰竭病人血浆对体外培养肝细胞有毒性作用