利用密码子优化的新霉素抗性基因实现四膜虫的高效转化.ppt

利用密码子优化的新霉素抗性基因 实现四膜虫的高效转化 Tetrahymena thermophila：具纤毛的原生动物，是真核生物学研究中的重要模式生物。 Introduction 优点： 细胞大，约50μm，便于显微操作 繁殖速度快，代时约2h 培养条件简单 菌株保存，遗传操作，基因寻靶等技术均已清楚 在基础生命科学研究中贡献： 动力蛋白的发现 微管蛋白翻译后修饰的分析研究 端粒结构及端粒酶活性的研究 RNA的自剪切研究 组蛋白修饰研究 DNA转录成RNA的调节 小RNA介导的异染色质的形成 可用于Tetrahymena转化的技术手段： 同源重组技术(homologous recombination) 基因插入和置换技术(gene disruption /replacement) 显微注射法(Microinjection) 电穿孔法(electroporation) 基因枪转化 (biolistic transformation) DNA介导的转化扩大Tetrahymena作为模式生物的使用范围 新霉素抗性基因(neomycin resistance gene，neo) 新霉素家族抗生素：如巴龙霉素(Paromomycin)，是抗微 生物药物，能与rRNA结合而抑制蛋白质的合成。 作用对象：真核生物、某些原核生物如变形虫，纤毛虫， 利什曼虫。 细菌转座子Tn5上的neo：能编码磷酸转移酶II ，使抗生 素磷酸化而失去活性。 Neo在Tetrahymena内的异常表达能使Tetrahymena对巴龙霉素有抗性。因此，在Tetrahymena的转化试验中neo被用作巴龙霉素的抗性标记 目前已有两种巴龙霉素抗性标记盒：neo2 和 neo3 neo2：5′端序列(包括启动子和5′UTR)来自Tetrahymena 组蛋白H4基因 HHF1；the neo gene；3′端序列(包括3′UTR 和poly A)来自Tetrahymena微管蛋白基因BTU2 neo3：5′端为MTT1序列，其他同Neo2 HHF1 promoter：能构成性地诱导基因表达。 MTT1 promoter：能被大量的金属离子，特别是Ca离子诱 导。在Ca离子存在时，基因能大大的表达。 neo3优缺点 与neo2比较，在相同情况下，neo3能多产生100倍 的抗性转化物 虽然neo3已经提高了在Tetrahymena内转基因试验的结 果，但转化效率仍不足以用于转基因菌株的有效生产及cDNA 或基因组DNA文库的筛选。 本研究的目的与结果 目的: 提高获取转化株的效率，本研究构建了密码子优化的neo4。 取代原因：细菌neo的密码子使用情况与Tetrahymena genes 的不同，这可能抑制neo 在Tetrahymena中的翻译，导致抗性 转化株数量的减少。 neo4：neo3中的neo被neoTet取代。 结果：EMA1基因座破坏试验中， neo4比neo3多产生大约 10倍的抗性克隆株 neo4的发现将推进Tetrahymena的生物学研究 Materials and methods 菌株：野生型T. thermophila CU428 培养条件 SPP培养基：优质朊间质蛋白胨培养基(含2%朊间质蛋白胨) 培养温度： 30 °C 指数生长期细胞(3–5×105/ml) 预处理：30 °C，10 mM Tris (pH 7.5),饥饿处理12–24 h 一、菌株与培养条件 二、质粒pNeo3(又称pMnB2)的构建 AccI–NotI fragment（含有MTT1–neo1–BTU2 fusion gene） 从pΔGMMII上的释放 利用T4 DNA polymerase 使形成平末端 克隆进 pBluescript SK(+) vector的EcoRV位点 pNeo3构建的3个步骤： MTT1–neo1–BTU2 fusion gene ：p0.9 kb MTT1 5′端包括 ATGstart Codon，neomycin resistance gene of Tn5，0.3 kb BTU2 3′端包括TGA stop codon连接而成 original neo gene 限制性酶切位点 三、质粒pNeo4和pEMA1-KO-neo4的构建 neoTet：以细菌Tn5的neo为基础，根据Tetrahymena codon usage优化而来。neoTet产物中所有氨基酸均由Tetrahymena 中高频密码子编码。 侧链为Eco31I识别序列的neoTet的合成