指示微生物检测2012.ppt

2、卫生学意义 大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量的重要指标，作为食品中的粪便污染指标。 食品中检出大肠菌群，表明该食品有粪便污染，既可能有肠道致病菌存在，因而也就有可能通过污染的食品引起肠道传染病的流行。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。 1、 样品的稀释 按第一法中的稀释方法进行。 （1） 选取2个～3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种两个无菌平皿，每皿1mL。同时分别取1mL生理盐水加入两个无菌平皿作空白对照。 （2） 及时将15 mL-20mL冷至46℃ 的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA ）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL-4mLVRBA 覆盖平板表层。翻转平板，置于36℃±l℃ 培养18h-24h 。 2、 平板计数 ? （3） 平板菌落数的选择 选取菌落数在15-150 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm 或更大。 2、 平板计数 ? （4）、 证实试验 从VRBA 平板上挑取10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管内，36℃±1℃ 培养24h-48h ，观察产气情况。凡BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。 2、 平板计数 ?（5）大肠菌群平板计数的报告 经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以（3）中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每克（或毫升）样品中大肠菌群数。 2、 平板计数 例：10-4样品稀释液1 mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取 其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105 CFU/g（mL）。 GB/T 4789.3-2008新增大肠菌群PetrifilmTM测试片法 准备PetrifilmTM测试片 接种1ml样本液 缓慢盖上上层膜 用压板轻压培养基 样本接种结果 红色有气泡的菌落确认为大肠菌群 比较区别 GB/T4789.38 – 2012 大肠埃希氏菌的计数 二、大肠埃希氏菌的计数 1、样品的稀释2　初发酵试验 每个样品，选择3 个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3 管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤）, 36℃±1℃ 培养24h±2h ，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h±2h 3　复发酵试验 用接种环从所有48h±2h 内发酵产气的LST 肉汤管中分别取培养物l环，移种于已提前预温至45℃的EC肉汤管中，放入带盖的44.5℃±0.2℃水浴箱内，培养24h±2h ，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h±2h。记录所有48h±2h 内产气的EC 肉汤管数。 4.伊红美蓝平板分离培养 轻摇各产气管，用接种环取培养物分别划线接种接种于EMB平板，36℃±1℃ 培养18h-24h，取培养物进行革兰氏染色和生化试验。。5.鉴定。 IMViC试验为++--6.　大肠埃希氏菌MPN计数的报告。 可疑菌落特点： 具有金属光泽的深紫黑色菌落； 不带或略带金属光泽的菌落； 中心色较深的淡紫黑色菌落。 大肠埃希氏菌MPN计数 初发酵 复发酵 伊红美蓝平板分离培养 营养琼脂斜面或平板培养 生化试验 大肠埃希氏菌VRB-MUG平板计数法 检验时用已知MUG阳性菌株（如大肠杆菌ATCC25922）和产气肠杆菌（如ATCC13048）做阳性和阴性对照 　三、粪大肠菌群计数GB4789.39-2008 1.样品稀释制备2　初发酵试验 　对每个样品,选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤,每管接种1mL。 3　复发酵试验 　用接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5℃水浴箱内,培养24±2h。水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。记录EC肉汤管的产气情况。产气管为粪大肠菌群试验阳性；不产气管为粪大肠菌群试验阴性。4. 粪大肠菌群MPN计数的报告：按产气管数,查MPN表报告每克(毫升)样品中粪大肠菌群的MPN值 酱油（GB/T2717-2003）： 细菌菌落总数： ≤30000 CFU/mL 大肠菌群： ≤30MPN/100mL 肠道致病菌： 不得检出 酱油（GB/T2717-2003） 细菌菌落总数： ≤30000cfu/ml 大肠菌群： ≤30MPN/100m