基因递送系统.doc

基因载体系统 刘华祥人类基因组计划取得超乎想象的飞速进展，促使人们对基因治疗的前景充满信心。要成功地实施基因治疗，必须具备三个关键因素：针对性的治疗基因；基因送系统；基因表达调节系统。目前基因治疗实验的基本步骤在某些实验中从病人的血液或骨髓中取出细胞，并在加速繁殖的实验条件下生长。然后，把需要的基因借助于不起作用的病毒嵌进细胞选择出获得成功改变的细胞再加速繁殖，再回到病人的体内另一种情况，脂质体（脂肪颗粒）或不起作用的病毒可被用于把基因直接输进病人体内细胞。基因治疗的一个主要目标是用一种缺陷基因的健康复制去提供给细胞。基因治疗对治疗人类多种疾病有潜在的优势，并产生很低的副作用。虽然对作为疾病治疗手段的基因治疗充满巨大的希望，但开发高效临床医疗方案的进展仍然缓慢，问题在于安全和有效的基因输送系统的开发基因表达的长效和稳定性，在这方面还有很长的路要走基因治疗是一种在对疾病治疗产生巨大影响之前，仍需几年才能达到的强有力的新技术。目前还存在几个主要的问题，包括在病毒和非病毒中微弱的输送系统，基因被输送后微弱的基因表达。人类疾病中转基因和基因表达低效的的是我们仍未掌握应如何构思载体的方法，比如，哪一种细胞类型适合什么类型调节序列，如何克服体内免疫对抗，如何按我们的要求去制造载体等等。　　虽然病毒系统潜在的高效，但对将来作参考选择的非病毒基因输送系统提出两种建议：安全，制造方便。能设计出全部合成基因输送系统以避免产生结合病毒的危险，或由生物活性病毒颗粒工程化的其它毒素效应。还有，生产不应该比想象中的细菌那种组织细胞培养更复杂QA/QC步骤应简单化。,广泛使用的基因递送系统可分为病毒与非病毒基因递送系统。病毒基因递送系统的转染及表达效率高,但存在潜在的野生型感染、致癌性、免疫原性等毒副作用,且受病毒自身体积的限制,装载目的基因的容量常有一定限制[1]。 病毒可进入寄主DNA ,但大多数野生型病毒对机体都有致病性,需改造才可用于人体。将病毒基因中与致病相关的基因去除,而保留其携带基因进入人体的功能,再组装成理想的外源基因,这种病毒即可成为病毒载体(viral vector)[2]。 理论上各种类型的病毒均可被改造成病毒载体,但由于人们对许多病毒的认识不够等限制,近20 年来,仅有少数几种病毒被成功地改造为基因转移载体(gene transfer vector) ,并应用于临床。 1.1 逆转录病毒(retrovirus ,RV)载体 逆转录病毒是一种RNA病毒,基因组大小在8～11kb 之间。逆转录病毒经寄主细胞表面的受体蛋白识别后进入细胞,然后在自身基因组编码的反转录酶的作用下,以基因组RNA为模板反转录出双链DNA。双链DNA 能够随机整合到寄主细胞的染色体上,随着寄主细胞的复制而复制[2]。 逆转录病毒是应用最早,研究相当热门的病毒载体,目前仍被广泛应用。体内有效的基因治疗需要有足够高的感染率( 107 cfu/ml) ,大部分逆转录病毒载体都很难达到,因此逆转录病毒载体更适用于体外转染[3]。 逆转录病毒载体的最大优点是能够将携带的外来基因整合进入细胞的基因组中，永不丢失。缺点是该载体偕同基因只能被整合入正在分裂的细胞的基因组中，且基因载体整入细胞基因组的过程是随机的，可以整入细胞基因组的任何一个位点，如果整入一个重要的细胞基因，将引起该基因的破坏。 1.2 腺病毒(adenovirus ,Ad)载体 Ad 为一DNA 双链无包膜病毒,基因组长约36kb ,由非结构基因E1(E1A、E1B) 、E2A、E2B、E3、E4 组成,和编码结构蛋白的基因L1-L5 等组成。Ad 载体的构建一般采用同源重组,现在最常用的是缺失了整个E1A 和部分E1B 基因的Ad2及Ad5型载体。E1区的缺失造成了病毒复制缺陷,同时为外源基因的插入提供了空间。此为第一代腺病毒载体,治疗的疾病包括肿瘤、遗传病、心血管病等。腺病毒载体解决了对于那些不正在处于分裂的细胞，逆转录病毒载体不能有效地整入的问题；Ad载体还能够高效率地携带基因进入细胞，携带的基因在细胞中有良好的表达，治疗作用明显[2]。 其不足是载体本身的基因所编码的几种病毒蛋白是免疫性较强的抗原(非己蛋白分子)，人体对这些病毒抗原发起程度不同的免疫反应，反应程度因人而异。在反应强烈的人体中，不仅可破坏载体所携带的基因的表达，撤消治疗作用，而且可导致较严重的病症，甚至死亡。在宾西法尼亚大学基因疗法试验中不幸死去的Jesse Gelsinger就是因为腺病毒载体引起的免疫反应。另外，其载体和所带基因在细胞中不是永远地存留，治疗作用可维持几个星期到几个月甚至更长的时间[2]。 1.3 腺相关病毒(adeno-associated virus ,AAV)载体 AAV属微小病毒科