染色体文库的构建及筛选.pptx

染色体文库的构建及筛选;什么是染色体文库？;基因组文库的构建;构建文库所使用的载体主要有： λ噬菌体(噬菌斑) 粘粒(菌落) 酵母人工染色体 (构建高等真核生物基因文库设计);A．λ噬菌体载体 ;B．粘粒 ;C、酵母人工染色体载体;载体DNA的制备;基因组DNA克隆片段的制备;重组DNA的产生;基因组文库的大小及代表性;cDNA文库的构建;mRNA的提取;LOREM;cDNA第一链的合成;cDNA第二链的合成;双链cDNA末端的处理;N = f为某一特定cDNA（mRNA）的分子数目与全部cDNA (mRNA）数目之比;差减cDNA文库（扣除文库）;从基因文库中钓取目的基因;二、差示杂交法 对表达率较高的目的基因有效 步骤：将一种可以转录目的基因的细胞(A)与另一种不能表达目的基因的细胞(B)分别涂布在相应A、B培养皿上。A中加入血清(生长因子)生长一段时间后，分别从两组细胞系中分离纯化总mRNA。将A组合成cDNA并克???，用硝酸纤维素薄膜复制两份。同时分别用两组的mRNA制备放射性cDNA探针，杂交处理后的薄膜，在进行原位比较。A足cDNA杂交膜上存在B组不存在的相应克隆必定含有目的基因。 三、PCR筛选 四、表达文库的免疫学筛选 对于用表达质粒或噬菌体构建的cDNA文库，可以用表达产物的特异抗体为探针进行筛选。;一、染色体步移 从基因组文库中反复筛选相互重叠的基因组片段 根据已克隆的基因片段的末端序列合成探针，或是以限制性核酸内切酶切下的末端片段为探针，反复筛选直至满居需要。 二、杂交捕捉和释放 用混合的cDNA与mRNA进行杂交，将mRNA离体转译，当转译由于杂合分子形成而被抑制时，成为杂交捕捉转译。通过对混合cDNA再次分组，反复杂交捕捉转译，鉴定出抑制某一特定蛋白转译的单个cDNA克隆。另一种方法为杂交后用磁珠分离等方法提取杂合分子，将其中mRNA释放并体外转译从而鉴定编码该蛋白的cDNA克隆称为杂交释放转译 ;其他方法;从非全长cDNA文库中筛选;从全长cDNA文库中筛选;