段旭昌免疫磁珠分离技术(IMB)及在食品生产中的应用.ppt

一 磁性微球 是通过一定方法将磁性无机粒子与有机高分子结合形成的具有一定磁性及特殊结构的体积在几纳米到几十微米之间的复合微球。 高分子磁性微球表面具有众多表面功能基 团，同时具有磁响应性，在外加磁场作用下具有磁导向功能。目前已广泛用于生物医学、细胞学和分离工程等领域。 二 磁性微球结构、分类及特点 对磁性微球的要求：粒径均匀、大小合适、比表面积大、吸附力强、具有强的超顺磁性、悬浮均匀稳定性好、不易聚集沉淀、表面具有多种活性基团、理化性质稳定、具有较好生物相容性、对细胞、机体、活性物质损伤小。 由于环氧基、氯甲基功能基团非常活跃，不需连接其他活性基团即可与生物配基（如抗体、抗原等）偶联，及其他基团的微型磁珠在生物学、医学方面应用较为广泛。 三 磁性微球的制备 磁性微球制备方法：共沉淀法、悬浮聚合法、乳液聚合法、分散聚合法、包埋法及原子转移自由基聚合法等。 1.共沉淀法 2聚合法制备磁性微球过程 四 磁性微球分离技术MACS(Magnetic Activated Cell Sorting) 是将免疫学+细胞生物学+磁力学结合为一体，利用磁性微球表面功能基团的专一亲和特性或多孔吸附特性吸附特定组分，然后用外力磁场作用将吸附了特定物质的磁珠加以分离，再经过洗脱磁珠上吸附的目标物质的一种新型分离技术，具有广泛的用途。 六 免疫磁珠的结构与性质 免疫磁珠核心为顺磁性粒子，核心外层包裹一层高分子材料， 最外层是免疫配基。 七 免疫磁株的特点 磁性微球与免疫配基结合牢固。 不影响或改变免疫配基原有的生物特性和特异性。 免疫微球的识别专一性。 在磁场中具有顺磁性，离开磁场磁性消失，易于分散。 八 免疫磁珠的分类 根据磁珠在磁场中受力大小及磁珠体积，分为小磁珠和大磁珠。 大磁珠：1-5um，粒径较大、悬浮稳定性差、易沉淀、比表面积小、吸附能力低、吸附活性配基少、对细胞影响大，特别是阳性分选时需将磁珠与细胞解离后方可进行下一步实验。但磁力强，无需特殊分离柱即可实现样品分离，分离速度快、过程简单、成本低。 小磁珠：50nm以下，粒径较小、悬浮稳定、比表面积大、表面吸附活性配基多，只有细胞体积的万分之一，对细胞表型和功能影响小，不影响细胞的后续培养。但磁力弱，需特殊分离柱才能实现样品分离，分离速度慢，成本高 九 免疫磁珠的制备 基本原理：磁性微球经过一定处理后,将抗体结合到磁珠上,形成免疫磁性微球（标记磁珠）,标记磁珠的抗体与特异性抗原结合形成抗原—微球复合物,该复合物在磁场中具有与其它组分不同的磁响应性,在磁力作用下,该复合物发生力学移动,从而达到分离抗原的目的。 免疫磁珠标记方法 1 直接磁珠和直接标记法 通过物理吸附和共价键结合直接将特意性抗体与磁珠耦合，然后再与相应细胞结合，形成细胞-抗原-抗体-磁珠复合物，在外磁场下直接分离目的细胞。快速、简单、特异性和细胞得率高，灵敏度低，需制备相应的偶联抗体磁珠。 2 简介磁珠和间接标记法 使用anti-lg等与磁珠偶联，通过Anti-lg再使磁珠与二抗体偶联，分离细胞时，先使细胞与一抗特异性结合，然后在与一抗标记磁珠结合，形成细胞-1抗-2抗-anti-lg-磁珠复合体，在外磁场下分离目的细胞的方法。该法增加了细胞的洗涤步骤，特异性也会降低。该法一般用于①没有直标磁珠抗体②需用几种抗体去除多种细胞③目的细胞上特异性抗原分子表达水平低。 MACS微珠 免疫磁珠分选方法 阳性分选：运用特异性抗体偶联磁珠直接从细胞混合物中分离目的细胞的分选方法称为positive selection. 阳性分选中磁珠标记的细胞即为目的细胞。该法简单、快速、细胞得率和纯度较高。如采用anti-CD14磁珠分选CD14+巨噬细胞。 阴性分选：用抗体偶联磁珠去除无关细胞，使目的细胞得以纯化和分离的分选方法称为negative selection.阴性分选中磁珠标记的细胞为非目的细胞。如分离CD4+T细胞时，由于没有专用的CD4+T细胞分选磁珠，可通过anti-CD8、 anti-B220、 anti-CD49b、 anti-CD11b、 anti-Ter119标记磁珠去除CD8+T细胞、B细胞、NK细胞、DC细胞、巨噬细胞、粒细胞等，最终而获得较纯的CD4+T细胞。因此阴性分选法适用于：①从细胞混合物中去除某种类型细胞。如肿瘤细胞。②缺乏针对目的细胞筛选的特异性抗体磁珠时。③抗体和目的细胞结合可能诱导细胞活化，影响后续细胞功能分析时。 复合分选：将阴性分选和阳性分选相结合的分选方法。当目的细胞含量特别低，无法直接进行阳性分选时，可采用阴性分选发先出去其他杂细胞，当目的细胞富集到一定程度时在采用阳性分选发筛选目的细胞。 免疫磁珠与细胞解离 1 过夜培养法：