Tricine- PAGE凝胶电泳.doc

Tricine- PAGE 实验原理’-methylene-bis-acrylamide 甲叉双丙烯酰胺 1.5g 双蒸水定容至100ml，滤纸过滤除去不溶物； 堆积胶贮存液： Acrylamide 30g N,N’-methylene-bis-acrylamide 0.8g 双蒸水定容至100ml，滤纸过滤除去不溶物； 分离胶缓冲液： Tris base (3mol/L) 三羟甲基氨基甲烷 36.342g SDS (0.3% ，十二烷基磺酸钠) 0.3g 用6mol/L HCl调整pH值为8.9，双蒸水定容至100ml； 堆积胶缓冲液： Tris base (1mol/L) 6.057g 用6mol/L HCl调整pH值为6.8，双蒸水定容至50ml； 阳极缓冲液： Tris base (0.2mol/L) 24.228g 6mol/LHCl调整pH值为8.9，双蒸水定容至1000ml； 阴极缓冲液： Tricine (0.1mol/L) 17.92g Tris base (0.1mol/L) 12.114g SDS (0.1%) 1g 自然pH值约为8.25，双蒸水定容至1000ml； 过硫酸铵： 称取(NH4)2S2O3 1.0 g，溶于10.0mL双蒸水中，分装成每份1mL，-20℃贮存；4℃避光贮存 20mL 考马斯亮蓝Coomassie brilliant blue； 0.05g 加双蒸水搅拌溶解后滤纸过滤除去不溶颗粒；(1L、100ml、10ml)、烧杯、离心管(15ml、1.5ml)、移液器、移液器吸头、干燥器、涡旋振荡器和废液缸等。 凝胶配方： 分离胶：(两块胶，20%T，3%C) 双蒸水 2.233ml 分离胶缓冲液 3.333ml 分离胶贮存液 4.522ml 甘油 1.067ml 10% AP 34?l TEMED 4?l 空间胶：(两块胶，16.5%T，3%C) 双蒸水 1.38ml 分离胶缓冲液 1ml 分离胶贮存液 0.6ml 10% AP 10??l TEMED 1??l 堆积胶：(两块胶，3.9%T，2.6%C) 双蒸水 2.94ml 堆积胶缓冲液 0.542ml 堆积胶贮存液 0.741ml 10% AP 43??l TEMED 3?l 样品处理： 在密封的螺盖微量离心管中，将超低分子量标准蛋白溶液按1:40的比例用1×样品缓冲液稀释，65℃加热2分钟，每孔加10?l； 在密封的螺盖微量离心管中，将样品溶液用1×样品缓冲液等比例稀释，100℃加热5分钟，每孔加20?l； 凝胶制备： 将玻璃板用蒸馏水清洗干净，再用75%的酒精去脂，干燥后固定在灌胶支架上； 按配方制备分离胶，加入TEMED前抽真空10min以除去丙烯酰胺溶液中的空气；加入TEMED后轻轻振荡混匀，迅速注入安装好的玻璃板的间隙中，留出足够的空间(堆积胶厚度约1cm；空间胶厚度约0.5cm)。在丙烯酰胺溶液上覆盖一层水饱和的正丁醇，以防止空气扩散到凝胶中抑制聚合作用；在室温条件下，凝胶应在60min左右聚合完成。 倒掉覆盖层并用蒸馏水清洗凝胶顶部数次，并用滤纸条吸净残留的蒸馏水。按配方制备空间胶，加入TEMED前抽真空10min，加入TEMED后轻轻振荡混匀，迅速注入分离胶上方，厚度约0.5cm，在丙烯酰胺溶液上覆盖一层水饱和的正丁醇；在室温条件下，凝胶应在40min左右聚合完成。 倒掉覆盖层并用蒸馏水清洗凝胶顶部数次，并用滤纸条吸净残留的蒸馏水。按配方制备堆积胶，加入TEMED前抽真空10min，加入TEMED后轻轻振荡混匀，迅速注入空间胶上方，立即插入干净的梳子，不要混入气泡，以免影响凝胶的聚合；在室温条件下，凝胶应在30min左右聚合完成。堆积胶聚合后小心移去梳子，避免破坏加样孔，用蒸馏水小心清洗加样孔，以除去未聚合的丙烯酰胺。 加样： 将凝胶固定在电泳装置上，电泳上槽内加入阴极缓冲液没过加样孔，并确保没有阴极缓冲液从电泳上槽漏出；电泳下槽内加入阳极缓冲液，倾斜整个装置以赶走凝胶下面可能留有的气泡。按预定顺序加样，每孔加入20?L，在对照孔中加入分子质量标准品10?L，如有空置的加样孔，加入等体积的1×加样缓冲液。 电泳： 将电泳装置与电源连接进行电泳，样品在堆积胶和空间胶阶段电压为70V，而在分离胶阶段电压调整为120V。直到溴酚蓝到达分离胶的底部后，关闭电源，这个过程大约需要3小时。 固定： 从电泳装置上卸下玻璃板，小心剥下凝胶后切除一角以标注凝胶方位；先将凝胶用双蒸水清洗5分钟，以降低背景色；将凝胶用新鲜配制的5%的戊二醛溶液固定1