猪脾脏淋巴细胞分离.ppt

猪脾脏淋巴细胞分离与细胞计数 华南农业大学生命科学学院微生物学教研室 张玲华课题组 一、实验目的 掌握密度梯度离心的原理及方法 掌握细胞计数板的工作原理及使用方法 二、实验原理 聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F／H)分层液(商品名为淋巴细胞分离液) ,比重 1.077±0.001 。 红细胞、粒细胞比重大，约为1.090，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，约为1.075，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中；血小板的比重最小，约为1.030，离心后浮于分层液上面。 借助密度梯度离心，吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。 细胞计数板  细胞计数 数上不数下，数左不数右。 大方格 中方格 每个大方格的容积是0.1mm3 4 4个大方格内细胞总数 单个核细胞浓度（细胞数/ml) ×104×a = (稀释倍数） 活细胞百分率 = 活细胞数 细胞总数 × 100% 细胞活力检测：（死细胞被染成蓝色，活细胞不着色） 细胞数量： = 5个中方格内细胞总数 ×5 × 104×a (稀释倍数） 三、实验材料 材料：猪脾脏 仪器：离心机，显微镜、超净工作台 用具：细胞筛、手术刀、手术剪、镊子、烧杯、吸管，培养皿、细胞计数器、离心管、肝素抗凝管 试剂：淋巴细胞分离液(比重1.077±0.001）、无Ca2+、Mg2+的Hanks 液 注：Hanks 液为缓冲等渗液，类似营养液，保持细胞活性及完整性，可抵抗轻微的酸碱变化。 四、实验操作 破碎 机械破碎（细胞筛） 分离 密度梯度离心 洗涤 Hank’s液多次离心 计数 细胞计数板 破碎并过筛 剪一小块脾脏（先用Hank‘s液清洗掉表面的杂物），置于细胞筛（放在平皿上）中，用针头不断搓烂组织块，同时用Hank’s液（5mL）将细胞洗到平皿中。 转移组织液 倾斜地缓缓地将你的组织液沿着管壁加入分离液(5mL)上层，避免互混。 密度梯度离心 ← 分离的对象 在取淋巴细胞层的方法上，可以采用吸掉上层的血浆，或者直接缓缓从中间吸出约2mL的淋巴细胞层。 取淋巴细胞层 弃去上层血浆 将中间的淋巴细胞层（约2mL）移到新的离心管中 加入Hank’s液 加入Hank’s液至10mL，再1000rpm，5min后，弃上清，加入Hank’s液重悬，取少量细胞悬液计数。 加入Hank‘s液后，要混匀 为了彻底洗涤淋巴细胞的分离液残留，一般需要重复洗涤一次。 计数 取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合 先在低倍镜下找到中方格区域，再在中倍镜下进行细胞计数。 五、注意事项 往分离液加组织液时，要沿着管壁，缓慢加入，避免它们互混。 密度梯度离心后，弃去上层血浆时，要尽量轻，切勿打破形成的分层。 细胞计数时，要等量加入细胞悬液和台盼蓝染液，结果也要2倍。 整个实验操作要尽量快，避免细胞过度死亡。 思考题 1、台盘蓝染液如何配置？ 2、你认为本次试验成败的关键因素是什么？应该怎样把握？ 实验报告 标题 实验目的、实验原理、实验用品、注意事项这些基本参考实验指导（word版） 实验操作可以按照自己的理解去写，尽量简洁明了 实验结果及分析是重点，无论结果如何，尽量真实表现，有问题说问题，有发现说发现，有成就说成就，有建议说建议。。。。 评分标准 出勤情况 感性材料，如报告工整，白细胞的观察结果图片 理性材料，主要是实验报告中的结果汇报及结合文献分析。