琼脂糖凝胶电泳检测.ppt

仪器 1. 水平式凝胶电泳槽 2. 稳压电泳仪 3. 电炉 4. 紫外检测仪 5. 台式离心机 琼脂糖凝胶制备步骤 1. 洗净电泳槽、制胶槽、梳子、挡板，晾 干； 2. 插好挡板、梳子； 3. 配制1 %的 Agrose琼脂糖凝胶液：根据实验所需称取0.4克琼脂糖，放入制胶 的容器中（一般用三角瓶），然后加入40ml电泳缓冲液（1×TAE）； 4. 加热煮沸，使琼脂糖完全溶解； 5. 待Agrose琼脂糖凝胶液稍凉（约55℃左右，不烫手）后，加入 约1/1000的1 mg/ml溴化乙锭溶液（约3.5 μL至终浓度为0.5-1 μg/ml）后轻轻混匀，倒入制胶槽上，勿起气泡（避免剧烈摇晃产生气泡）； 6. 室温下约30分钟后，琼脂糖溶液完全凝固，小心垂直拔出梳子和挡板，清除碎胶，将凝胶放入电泳槽中； 7. 加入电泳缓冲液（1×TAE）至电泳槽中，使液面高于胶面约1mm； 8. 在DNA样品中加入2μL (1/10体积)的10× DNA上样缓冲液(loading buffer)，混匀，稍甩一下，使溶液都处于离心管底； 用移液器吸起离心管中溶液，移入凝胶的梳孔中； 插上导线，打开电泳仪电源，按照需要调节电压至100V，电泳开始，观察电流情况或电泳槽中负极的铂金丝是否有气泡出现； 等溴酚蓝泳动至凝胶前沿后，将电压（或电流）回零，关闭电源，停止电泳； 取出凝胶，在紫外观测仪上观察电泳结果； 根据需要切下DNA条带，放入1.5ml Ep管中，放于4℃保存，以备下周实验用。 实验结果及讨论 质粒DNA在琼脂糖凝胶中一般为三条带，最前面的条带为超螺旋构型，中间为线型，最后为单链有缺刻的构型。 本实验PCR产物大小约在1100-1200bp之间 * * 琼脂糖凝胶电泳检测 了解琼脂糖凝胶电泳的原理 掌握琼脂糖凝胶的制作及进行电泳的方法 琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中常规的实验方法，它能检测少量的DNA（如用肉眼观察，可检测到10 ng的DNA），且检测的范围很广。 琼脂糖凝胶电泳对DNA分子的检测，主要基于在凝胶中加入溴化乙锭，这样溴化乙锭分子就会嵌入DNA分子中形成络合物，使DNA在紫外光下发射很强的荧光，而在紫外光下DNA发出的荧光是可见光。 在溴化乙锭足够的情况下，荧光的强度正比于DNA的含量，因而DNA的检测很方便。如将已知大小和浓度的标准样品（Marker）作电泳对照，就可估计出待测样品的大小和浓度。 50×TAE电泳缓冲液（pH8.0）: Tris 242g 冰醋酸 57.1ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 100ml 稀释到电泳缓冲液1×TAE 溴化乙锭溶液 :10mg/ml水溶液，室温，棕色瓶或铝铂纸包装保存。 4. 10×(6×) ×DNA样品上样缓冲液 (Loading Buffer,溴酚蓝指示剂, DNA样品加样缓冲液) 琼脂糖Agarose pMD18-T Vector ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 使用3 mg的DNA Marker DL　2,000（500 ng/条带）进行1%的琼脂糖凝胶电泳后，各DNA条带自上至下分别为2kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp。