生物工程下游技术 色谱分离.ppt

Chapter 7色谱分离(层析分离) (CR) Chromatographic Resolution  7.1 概述 概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质）和流动相，利用多组分混合物中各组分物理化学性质(如吸附力、分子极性、分子形状和大小、分子亲和力、分配系数等)的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，当多组分混合物随流动相流动时，由于各组分物化性质的差异而以不同的速率移动，使之分离--经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸…），达到分离的目的。 色谱分离方法的分类 按原理不同分： 吸附色谱(Adsorption C.)：吸附力不同(物理、化学) 分配色谱(Distribution C.)：分配系数不同 离子交换色谱(IEC)：离子交换树脂的化学亲和力差 凝胶色谱：分子大小或形状不同(Gel C.)分子筛色谱 亲和色谱(Affinity C.)：生物大分子的专一结合能力 1）迎头法（frontal method） 2）顶替法（displacement development） 7.2.2 色谱分离的分配机理 可由Langmuir方程得出 Kd分配系数，反应了消耗在固定相上的时间及在柱中的停留时间。 q、c溶质在固相和液相中的浓度 保留时间（tR）和保留体积（VR） 反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的基本热力学参数之一 阻滞因子Rt 阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相 Kd=0）的迁移率之比 其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小 洗脱体积 色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱体积 不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所差异 色谱柱的理论塔板数、塔板高度 反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系 理论塔板数的计算方法： N理论塔板数 tR保留时间 W1/2半峰宽 Wb峰底宽度 理论塔板高度： L柱长 7.3.1 吸附色谱(absorption chromatography) 原理:利用溶质与吸附剂之间的分子吸附力(范德华力，包括色散力、诱导力、定向力以及氢键)的差异而实现分离 关键要素：吸附剂和展开剂的选择 吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺等，均含有不饱和的氧原子或氮原子以及能够形成氢键的基团，如-OH和-NH2 常用的吸附剂： 氧化铝 硅胶 活性炭 纤维素 聚酰胺 硅藻土 展开剂的选择 展开剂极性越大，对同一化合物的洗脱能力越大 因此，可以根据实验结果调整展开剂的极性以获得最佳的分离的效果 展开剂选择的原则： （1）对被分离组分应具有一定的解吸附能力，极性应比被分离物质的极性略小 （2）展开剂应对被分离物质具有一定的溶解能力 一般吸附色谱的操作程序 根据要分离组分的性质（包括极性、分子量、分子结构）选择合适的固定相和流动相 吸附操作：选择合适的操作条件（温度、pH值、流速），进行装柱、平衡、上样，测定穿透样品含量以调整操作参数 洗脱：采用有机溶剂洗涤、调节pH值以及体系离子强度，最大限度地回收目标产物 7.3.2 分配色谱 (partition chromatography) 原理：利用溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同而分离的方法 要素：固定相、载体、流动相 载体：通常为惰性材料，能吸附固定相液体 载体种类： 硅胶 硅藻土 纤维素 葡聚糖凝胶 固定相：通常选取各组分溶解度大的溶剂作为固定相 流动相可以是极性的（反相色谱法），也可以是非极性的（正相色谱） *反相色谱 固定相是非极性的流动相是极性的 6.3.3 HPLC HPLC Chromatogram 反相液相色谱 反相液相色谱分离多肽和蛋白质使基于蛋白质的疏水性，因此通常采用非极性的烷基固定相作为填料，其表面化学性质和流动相的选择应最大限度地满足疏水的要求 通常在流动相中加入离子对试剂（三氟乙酸）来增大蛋白质和多肽的疏水性 载体：微粒多孔硅胶（粒径5μm~20 μm ） Hypersil Spherosil XOB075 固定相：C18、C8烷基链，C8适于分离蛋白质 C18适于分离核酸 苯基 流动相的选择 通常采用有机溶剂，乙腈、异丙醇、正丙醇和四氢呋喃 6.3.4离子交换色谱(ion exchange chromatography) 利用固定相球形介质表面活性基团经化学键合方法，将具有交换能力的离子基团在固定相上面，这些离