睡眠剥夺对小鼠免疫的影响.ppt

睡眠剥夺对小鼠免疫能力的影响 组员：杜晨阳、辛凯悦、 李毅、朱灵凤、舒文静 实验对象—— 一组：健康雄性小鼠20只，体重22±2g,随机分成a组、b组，即正常对照组和慢性不完全睡眠剥夺组。 二组：健康雄性小鼠20只，体重22±2g,随机分成c组、d组，即正常对照组和慢性不完全睡眠剥夺组。 三组：健康雄性小鼠20只，体重22±2g,随机分成e组、f组，即正常对照组和慢性不完全睡眠剥夺组。 动物模型的建立 采用轻触法一、二组对小鼠不完全剥夺睡眠，每天剥夺睡眠时间从上午六点到下午五点结束。其中a组、c组是实验组，b组、d组是对照组。具体方法为：当实验组小鼠出现睡眠状姿势时，即用毛笔轻触小鼠使其保持清醒状态，当小鼠处于清醒状态时则不对其进行任何刺激，在睡眠剥夺过程中，正常对照组始终可以自由睡眠。一个周睡眠剥夺后，进行免疫功能的测定。 免疫功能的测定 器材：滤纸，粗剪刀，婴儿称 对象：第一组实验小鼠  实验步骤 实验步骤： （1）用颈椎脱臼法处死第一组小鼠并立即称取体液 （2）解剖摘取小鼠的胸腺和脾脏，用滤纸吸干残血后，称重（mg） （3）所得重量分别除以小鼠体重(g)，再乘以100％，即分别得到胸腺指数和脾脏指数。 胸腺指数=（胸腺重量/小鼠体重）×10脾脏指数=（脾脏重量/小鼠体重）×10 2.外周血T淋巴细胞亚群检测 （1）两组小鼠分别自眼底静脉丛取血，肝素抗凝。吸取抗凝全血100μL，加入预先调制好的FITC-CD3\PE-CD4\PE-Cy5-CD8 3种荧光标记抗体混合液12μL，并设置荧光同型对照。室温避光反应20min,然后加入红细胞溶解液，每份标本加1ml，混匀，室温避光10min,见细胞悬液呈亮红色时，说明红细胞被裂解，再加入含20mL/LFCS的生理盐水，以400g离心洗涤细胞2次，洗涤后的细胞最终回复到500μL （2）将两组液体移入流式专用管，上流式细胞仪检测 3.红血球凝集实验 红血球凝集指红细胞凝集的现象。由病毒、细胞凝集素和抗体而引起的红细胞凝集。在病毒而引起的凝集中，如果存在抗病毒的抗体时，则由病毒引起的凝集作用将被抑制，所以可用于抗病毒抗体的检出。 实验准备 器材：96孔“U”形或“V”形微量反应板，50 uL定量移液器，滴头，微型振荡器。 药品：特定病毒抗原，0.5%小鼠红细胞 对象：第二组实验小鼠 用特定病毒抗原对两组小鼠进行免疫，一定的时间后抽取小鼠血液制成血清滴在反应板上，用特定病毒进行滴加，观察血液凝剂情况并记录 对已经免疫的A组小鼠进行不同程度的睡眠剥夺，B组不做睡眠剥夺，然后对实验小鼠进行上述血凝操作，观察血凝情况 96孔微量反应板的清洗 　　将浸泡有75%乙醇的棉签放入微量反应板的每个孔内旋转，用自来水冲洗反应板5次，再用蒸馏水冲洗3次以上，置37℃温箱中干燥。 0.5%红细胞制备方法 　　先用灭菌注射器吸取3.8% 枸橼酸钠溶液(其量为所需血量的1/5)，从小鼠静脉或心脏采血至需要血量，置灭菌离心管内，加灭菌生理盐水为抗凝血的2倍，以2000r/min离心10min，弃上清液，再加生理盐水悬浮血球，同上法离心沉淀，如此将红细胞洗涤三次，最后根据所需用量，用灭菌生理盐水配成0.5%小鼠红细胞悬液。 统计学方法 所有数据均用均数± 标准差表示，各组均数间的差异显著性用t检验判断。P0.05表示差-异具有显著性；p0.01表示差异非常显著；p0.001表示差异极显著；p0.05表示差异不具有显著性。 参考文献 [1]洪军,马文龙.睡眠剥夺的对策[J].第一军医大学学报,2001,21(2):152—154[2]何志恒,印大中.睡眠研究的科学前沿[J].生命科学研究,2002,6(4):184—187[3]李洋,谢扬丽,胡志安.感染和免疫反应对睡眠的影响[J].生理科学进展,2007,38(2):187——190[4]赵忠新.临床睡眠障碍学[M].上海：第二军医大学出版社,2003:25—45[5]丁琳,胡晓波.睡眠剥夺对机体的影响[期刊论文].微量元素与健康研究,2010(6) 睡眠剥夺是指由于某种原因导致的睡眠数量被迫减少，它对机体的影响是十分明显的。它可以造成机体疲劳、作业能力降低、免疫力下降、警觉水平降低，并引起情绪改变、精神不振、粗心、注意力不集中、食欲下降、记忆力下降、工作效率低等不良反应。 不完全睡眠剥夺可导致免疫功能的下降. 机体内过量的自由基可对机体产生伤害,其重要原因是产生脂质过氧化物,造成对细胞结构和功能的破坏,从而导致衰老和各种疾病,机体内超氧化物歧化酶(SOD) 的功能是清除体内的氧自由基,从而对机体起到保护作用 ,增强免疫力. 有研究表明,长期睡眠较差的人的血清过氧化脂质明显偏高,红细胞SOD 活性明显偏低,从而导致机体免疫力