磁珠分选(xiu).ppt

免疫磁珠分选技术 技术原理 MACS（磁性细胞分选技术）是一种广泛用来磁性分选多种细胞或者生物分子的技术。 ? 基于抗体对抗原的特异性识别 ? 磁性微珠直接或者间接偶联在抗体上，从而与细胞相连 ? 在高强度、梯度磁场中达到细胞磁性分离的目的 组成成分 MACS微珠 MACS分选柱 MACS分选器 MACS微珠 与高度特异性单克隆抗体相偶联的超顺磁化微粒 直径约有50nm 无毒性，对细胞无损伤，可以生物降解 不影响细胞的光散射特性 磁性标记只占用20－30％的结合位点，不影响细胞的荧光抗体标记。 最大限度地避免细胞活化； 无需解离磁珠 MACS微珠主要有三种： 直标微珠 间标微珠: 抗免疫球蛋白微珠、抗生物素微珠或链霉亲和素微珠、抗荧光素微珠 多选微珠:专门为分选细胞亚群而研制的一种微珠。 这种微珠通过特殊的方式与抗体偶联， 在第一次阳性分选完成后， 与细胞结合的多选微珠 可以被解离试剂剪切下来， 阳性分选的细胞可以进行 再次阳性分选或者去除分选。 MACS分选柱是一类填充有不同规格铁珠的塑料容器，铁珠表面有亲水包被 MACS分选器由永久性磁铁和支架构成。与分选柱一起组成高强度的梯度磁场。根据应用范围分为研究用和临床应用的MACS分选器，根据操作方式分为手动和自动分选器。 MACS技术优点 1、MACS微珠由氧化铁和多聚糖组成，直径只有50nm，体积大约为真核细胞的百万分之一。2、微珠易于降解，对细胞无毒性，分选后细胞仍旧保持生理功能。3、与流式细胞仪兼容，分选后细胞可以立即用于分析和后续实验。4、高纯度、高回收率、高活性。 MACS分选策略 阳性分选 去除分选 复合分选。 阳性分选中，目的细胞被磁性标记后，作为阳性标记组分直接分选出来。阳性分选策略优点：纯度高，回收率高，操作迅速、简便 去除分选是把非目的细胞磁性标记后从细胞混合物中去除的方法，即未磁性标记的细胞为目的细胞。 去除分选策略适用范围 去除不需要的细胞； 缺乏针对目的细胞的特异性抗体（如肿瘤细胞）； 不需要抗体和目的细胞结合，即细胞不被激惹（如T细胞、B细胞、NK细胞功能分析）； 复合分选的一部分。 联合使用两种以上分选策略，主要用于细胞亚群的分选或者得到高纯度非常稀有的细胞。 适用范围： （1）非目的细胞也表达用来阳性选择的抗原 （2）分选非常稀有细胞，先去除非目的细胞再行阳性分选，可获得高纯度的稀有目的细胞。 步骤 查找合适的磁珠：首选直标磁珠，试剂盒 仔细阅读说明书，根据分选总细胞数，目的细胞数选择合适的柱子。合适的柱子对应合适的分选器 按照说明书进行操作 样本制备：制备单细胞悬液 磁珠标记：将磁珠与细胞共孵育 过柱：洗柱---上柱------洗脱 关键环节 ??? 1.抗体包被磁珠对死细胞常有非特异性结合.因而分选前去除死细胞; 2.上分离柱前,充分振荡,混悬细胞,打散细胞团块; 3.用分离柱分选, 减少水中气泡,使分离柱不被气泡阻滞; 分选过程中不能干柱 4.细胞悬液加入分离柱中时,应将滴管伸至底壁后加入,避免将细悬液沿管壁流入,使管壁残流末分选细胞,以致后继洗柱过程中,因疏忽末被洗下,最后导致纯度不高.洗柱时,应在前次液体充分流尽后,再加洗液. 5.分选细胞量应根据说明书控制,不超量;细胞计数准确 6.孵育时间和温度应按说明书进行,延长孵育时间、提高温度会增加非特异结合; 7.先用抗体阻断Fc受体,可降低非特异性结合 8.分选温度：低温。预冷分离液 ? 其他磁分选产品 Dynal 大磁珠 后续应用研究，如流式细胞术，则需要将Dynabeads 与靶细胞分离。 适用于高频细胞 stemcell MACS 与FACS MACS相比FACS的优点：1， 适合大批量的细胞分选，FACS分选速度相对而言要慢很多；2，稳定性高，重复性强，而FACS由于机器运行时间长会导致参数漂移故而实际获取得靶细胞阳性率会大大下降；3，无须大型设备，普遍适合大多数实验室的细胞分选工作；4，操作简单，无须专门的设备操作人员（FACS操作需要一定的经验）。FACS相比MACS的优点：1，少量细胞分选时比MACS精确得多，速度也快；2，可以多个marker分选、正选负选同时进行（比如CD117+/CD90lo/Sca-1+/CD45-），而MACS一般只能进行阳选或阴选，marker往往同时只能做一个（或一类）；3，抗体可以用荧光直接标的，也可用间标的（最好是厂家标明可以用于FACS），选择余地大，但是MACS的抗体往往需要和磁珠配套，选择余地小。 谢谢