CCK-8 常见问题汇总.docx

Cell Counting Kit(CCK-8)常见问题汇总1.一个孔中应接种多少个细胞？当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔 (100 μl 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 (100 μl 培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。2.能否用384孔板进行试验？可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液，如果加入的CCK-8体积太少，可以先将CCK-8溶液稀释1倍，然后加入培养基体积20%的量。3.能否用24孔板进行试验？可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液。4.酚红会影响检测吗？不会。培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。5.CCK-8与胸苷结合检测之间是否有相关性？有。然而，请注意由于CCK-8使用的检测原理与胸苷检测的不同，因此结果可能不同。6.CCK-8能否检测细菌细胞？可以检测E.coli，但不能检测酵母细胞。向100 μl E.coli培养液中加入10 μl CCK-8溶液，并培养1-4个小时或过夜。7.CCK-8稳定吗？CCK-8很稳定，在避光0-5℃条件下可以保存2年。8.如果没有450 nm的滤光片，还可以使用哪些其他滤光片？还可使用450 nm到490 nm之间的滤光片。9.如何减少由于CCK-8试剂在枪头上或孔壁上的残留所带来的误差？可以在加样前用培养基稀释CCK-8试剂并混匀后加样。10.CCK-8是什么颜色？应该是粉红色。若颜色不一样，有可能会影响测定。11.CCK8能否对活细胞进行染色？不能。因为CCK8的主要成分是一种水溶性的四唑盐 (WST8)，并通过电子载体1Methoxy PMS将活细胞中的电子交换到培养基中的WST8上。由于生成的甲ā也是高度水溶性的，因此CCK8不能对细胞进行染色。12.CCK8检测溶液对细胞是否有毒？CCK8溶液自身因为高浓度的1Methoxy PMS的存在而具有一点毒性。但是，加到培养基中的CCK8是没有毒性的，因为被稀释了10倍。因此，长时间的培养，如过夜或者培养数天是可以的。同一个细胞培养液在CCK8检测后还可以用于其他细胞增殖检测，如结晶紫检测，中性红检测或者DNA荧光检测等。由于每种细胞对于CCK8的耐受力都不同，因此在需要进行长时间培养时，先检测一下细胞在加入CCK8培养后的活力。13.在做加药实验时，药物对测定是否有影响？如何解决？有时会有影响。如果药物具有还原性，会和CCK8发生显色反应，增加吸光度。解决办法：首先要确认药物是否有吸收，在含有药物的培养基中加入CCK8，测定450 nm的吸光度，如果它的吸光度比不含药物的培养基 (加CCK8)的吸光度高，则证明药物有影响，可在加CCK8之前更换培养基，去掉药物的影响。14.每次测定的数值不一样，是什么原因？如何解决？可能会有以下几个原因： 1. 当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。 一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。 2. 有可能会因为CCK8沾在壁上而产生误差，建议在加入CCK8后，轻轻敲击培养板以帮助混匀。 3. 每孔的细胞数量过多或过少。请预先在1,000100,000个/孔范围内摸索条件。15.如何设定空白对照？在不含细胞的培养基中加入CCK8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验(细胞毒性实验)时，还应考虑药物的吸收，可在不含细胞，加入药物的培养基中加入CCK8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度作为空白对照。16.哪些物质会影响CCK8的测定？当有还原性物质存在时会影响CCK8的测定，例如含有维生素C的Glucose等 (一般培养基中的量不多，酚红或血清不影响测定)。在有酚红存在的情况下，会增加空白吸收，但不影响测定，扣除空白吸收即可。17.在实验中吸光度值太高，如果不能减少细胞数量，如何解决？可以缩短加入CCK8后的培养时间。例如：可以把加入CCK8试剂后的培养时间由2小时缩短为1小时。18.设定参比波长的目的是什么？必须设定吗？不一定要设定。CCK-8试剂在参比波长没有吸光度。设定参比波长的目的是为了取出由于样品混浊所带来的吸收。19.说明书上仅写了96孔板的测定方法，如果使用24孔板货12孔板，应该加多少量CCK-8试剂？…一般情况下建议加入CCK-8试剂的量是培养基体积的1/10。20.在CCK-8显色过程中，如何终止反应？有一下几种方法（96孔板）： 1、 在显色反应后，将培养板放置4℃冰箱内。 2、 每孔加10 μl 0.1 M HCL溶液。 3、 每孔加