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GUS组织化学染色
GUS组织化学染色1. 实验原理适宜的反应条件下,β-葡聚糖苷酶(GUS)可将X-Gluc水解成蓝色物质,因此具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点,可用肉眼或显微镜观察到。2. 实验材料1)??转基因烟草叶片或试管苗2)??非转基因烟草的叶片或试管苗(阴性对照)3. 药品试剂1)??X-Gluc,用N-N-二甲基酰胺配成20mM的贮存液,分装成每管100μL,保存于-20。2)??底物溶液(染色液):3)??1mM X-Gluc加入100mM磷酸钠缓冲液(pH=7.0),缓冲液中含10mM EDTA-Na2,1-5mM K3[Fe(CN)6](铁氰化钾),1-5mM K4[Fe(CN)6](亚铁氰化钾),0.001%(V/V)Triton X-1004. 实验器材小药瓶,培养皿,培养箱(37),微量移液器5. 实验步骤1)??将准备好的叶片放入小药瓶,加入染色液浸没试材,封好盖子;2)??37培养箱中温育1小时至过夜;3)??将浸染过的试材转入70%或95%乙醇中脱色2-3次(除去叶绿素),至阴性对照材料呈白色为止。6. 结果叶片上GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点。
先用DMSO溶解X-GLUC 好像是100mg/2ml PBF 94ML+X-GLUC 0.1ML+TRITION X-100 2ML +FE2+ 2ML+ FE3+ 2ML
/plsc/labs/sherrierlab/Methods_pdf/microscopy/Protocol%20for%20Fluorescent%20GUS%20Staining%20of%20Root%20Nodules.pdf/stockingerlab/Protocols/GUS-HistochemicalStaining.pdfhttp://dps.plants.ox.ac.uk/langdalelab/protocols/misc/Dex_induc_GUS_stain.pdf
Gus staining 1. Excise root and leaf segments, wash with 100mM potassiumphosphate buffer (pH7.0) for 3 times.2. Immerse in the Gus substrate solution, 37C, dark, 12-24h3. Rinse in phosphate buffer4. Fix for 4h or longer5. Rinse in the same buffer6. Observe as whole specimens or as sections.1M potassium phosphate buffer (pH7.0)K2HPO4: 34.8g ---200mlKH2PO4: 27.2g----200ml184.5ml K2HPO4+115.5ml KH2PO4---- 300ml 1M potassium phosphate buffer(pH7.0)Gus substrate solutionVolume(500ml)Final concentrationPotassium ferricyanide 82mg0.5mM
Potassium ferrocyanide105.6mg0.5mMPotassium phosphate buffer (pH7.0, 1M)50ml100mMStore at -20C. Add 1mM x-gulc (MW521.8~~0.5mg/ml) freshly when use.Fix solution2.5% glutaraldehyde200mM sodium cacodylate, pH7.2
共培养后愈伤的瞬时表达、抗性愈伤的鉴定以及转基因植株的鉴定用GUS组织化学法测定.将待测定的材料,如愈伤或叶片,浸入适量X-Gluc溶液,于37 ℃保温过夜后,在体视显微镜下观察,拍照记录.若将加有X-Gluc溶液的材料抽真空,染色效果将更好.如材料存在色素干扰问题,染色后用酒精脱色,使色素的颜色褪掉而使染成的蓝色保存.X-Gluc染色液:(20*)
0.2 mol/L Na3PO4缓冲液(62 mL 0.2 mol/L Na2HPO4;38 mL 0.2 mol/L NaH2PO4),pH 7.0; 0.1 mol/L K3[Fe(CN)6];0.1 mol/L K4[Fe(CN)6].3H2O;1.0 mol/L Na2EPTA;0.1% X-Gluc.
1000ml
x-gluc 10
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