mtDNA提取方法.doc

实验一 线粒体DNA的RFLP分析 在哺乳动物中，线粒体DNA是一个约为16.5 kb大小的环状DNA 分子。mtDNA的遗传过程严格遵守单性母性遗传方式。由于mtDNA的结构简单，一级结构的碱基替代率高，世代间没有重组。因此它已经成为研究生物起源进化，探讨生物群体间遗传关系的一个重要研究对象。 mtDNA的多态性可存在于种间，品种间及品种内个体间。一般可区分为长度多态性和位点多态性两类，均可通过mtDNA限制性内切酶分析或mtDNA全序列或主要序列分析来检测。在此仅介绍动物线粒体DNA (mtDNA) 的限制性酶分析方法。 目前已发现有数百种限制性内切酶，其中100多种以上具有独特的识别特异性。一个特定的限制性内切酶能够识别4、5或6个特定的核苷酸序列，并在其附近切断磷酸二酯键。DNA经过限制酶切割所产生的DNA片段，根据其分子量大小的不同，通过凝胶电泳并经EB（溴化乙啶）染色即可把它们分开。在检查一个生物群体mtDNA时，首先从生物个体组织中提取mtDNA，然后通过一组限制酶分别消化，经电泳以获得mtDNA的限制性图谱。 因为家畜的mtDNA是一个闭合的环形分子，那么，由一个特定的限制酶切割所产生的片段数就等于mtDNA中该酶识别的位点数或切割位点数。如果因突变使其原来的酶切位点消失，或增加新的酶切位点都可通过限制性内切酶分析法被检出（图2）。通常，在典型的mtDNA消化中，识别“6个碱基”的酶可产生1～9个片段，而识别4个碱基的酶可产生20或20以上的片段。一般来讲，对于家畜mtDNA的研究，若用琼脂凝胶电泳，可用“5和6个碱基”的酶。 实验一 从动物组织中提取线粒体DNA 所需溶液和缓冲液： 1. Homo-缓冲液: 0.25 mol/L Sucrose 0.01 mol/L EDTA 0.03 mol/L Tris pH 8.0 高压灭菌 2. Lysis-缓冲液: 0.01 mol/L Tris 0.15 mol/L NaCl 0.01 mol/L EDTA pH 8.0 高压灭菌 3. NaOH/SDS-溶液: 0.18 N NaOH 0.1% SDS (由2 N NaOH and 10% SDS新鲜配制) I II 图2 某物种的个体I和个体II mtDNA 限制性酶切多态性模式图，上面是带有EcoRI切点的环形分子，下面是限制性片段长度多态性。左面的片段总和与右面相等。箭头指示一个新的酶切位点，片段a被切割成d和e两个片段。 4. KAC-溶液: 6.00 ml 5 mmol/L KAC 1.15 ml 冰乙酸 2.85 ml H2O deion. 5. 酚（Phenol） pH 8.0 6. 氯仿（Chloroform） 7. 100％和70％ 乙醇 8. TE-Buffer: 10 mmol/L Tris 1 mmol/L EDTA pH 8.0 高压灭菌 二、所需仪器设备和耗材： 制冰机，冰箱，冷冻低温超速离心机，常温高速离心机、移液器，旋涡振荡器，离心管架，真空干燥器，烧杯，试剂瓶，15 ml, 1.5 ml离心管, 吸头盒, 200 μl ,1000 μl 吸头等。 三、方法 1. 0.5-1.0 g 的组织匀浆在5倍体积的Homo-缓冲液中。 2. 300g离心 90 sec。 3. 上清液转到一个新的离心管，18000g 4℃离心15 min。 4. 上清液小心倒掉，给沉淀物中加入400 μl Lysis-缓冲液，用加样枪混匀。 加入 800 μl NaOH/SDS-溶液, 瞬时振荡混匀, 冰上放置5 min。 加入600 μl 冰冷的KAC, 瞬时振荡，冰上放置5 min。 11750g，离心5 min。 上清液转入一个新试管。 在抽风橱下工作！ 向上清液中加入1 ml酚（Phenol, pH﹥8.0）和1 ml氯仿， 短时振荡。 10. 11750g，离心 3 min。 11. 上清液转入一个新试管。 12. 为使mtDNA沉淀，加入2倍体积冰冷的