NK细胞活性测定.ppt

淋巴细胞功能测定 淋巴细胞功能测定的体外试验 淋巴细胞增殖试验 3H-TdR、MTT、形态学计数 细胞毒试验－－NK 51Cr、LDH释放法、细胞凋亡检测法 分泌功能检测 细胞因子分泌细胞的检测（ELISPOT） 抗体形成细胞的检测（溶血空斑试验） T细胞功能检测 T细胞亚群的检测 IL-2活性的测定 淋巴细胞转化实验 B细胞功能检测 抗体形成细胞检测（溶血空斑试验） EA花环试验（测定Fc受体） SmIg的测定（直接免疫荧光法） NK细胞活性检测（细胞毒试验） 吞噬细胞功能检测 自然杀伤细胞 属淋巴细胞；无特异性TCR；无须致敏即直接杀伤靶细胞。 表面标记 CD3-、CD56+、CD16+ 表面受体 （1）杀伤细胞活化受体（KAR） 结合靶细胞表面糖类配体，促使NK发挥杀伤作用。 （2）杀伤细胞抑制受体（KIR） 识别自身细胞表面MHC-I类分子，产生抑制信号。 主要生物学功能 抗感染与抗肿瘤；免疫调节 * NK活性测定 何谓NK？—NK概述 NK活性测定 实验原理 实验材料及试剂 实验步骤及结果判读 NK细胞不杀伤正常细胞 NK细胞杀伤靶细胞 NK细胞通过ADCC作用杀伤病毒感染的靶细胞 NK细胞杀伤靶细胞电镜图 胞 核 125I释放法 荧光染料释放法 NK细胞+靶细胞 靶细胞溶解、破裂释放 胞浆内酶类 LDH释放法 胞浆内蛋白 51Cr释放法 实验原理 效应细胞 靶细胞 释放LDH 丙酮酸 乳酸 乳酸脱氢酶(LDH) NAD+ NADH+H+ PMS NBT Formazan（OD570nm） 实验材料 1、LDH底物溶液（临用前配制） 2、1% NP-40 3、1mol/L柠檬酸终止液 NBT（硝基氯化四氮唑蓝） 4mg NAD+（氧化型辅酶I ） 10mg PMS（吩嗪二甲酯硫酸盐） 1mg 混匀后取1.6ml，加1mol/L乳酸钠0.4ml 加入2mlddH2O溶解 加入0.1mol/L pH7.4的PBS至10ml 实验步骤 效应细胞的制备（分离外周血单个核细胞） 靶细胞的制备 效-靶细胞相互作用 酶促反应 结果判读 取培养24~48hr的靶细胞(K562), 洗涤3次（1000rpm×10min）, 最后用完全RPMI-1640培养液调整细胞浓度至1×105/ml, 备用。 靶细胞的制备： 效应细胞的制备 （外周血单个核细胞分离） 采集静脉血2ml，加0.2ml肝素溶液（125-250U/ml）抗凝 吸取2ml淋巴细胞分层液置10ml离心管中， 将管倾斜45°，沿管壁缓缓注入抗凝血 离心2000rpm×20min 密度梯度离心分离外周血单核细胞 用完全RPMI-1640定容细胞，计数后调整细胞浓度 （加入0.2ml完全RPMI-1640 ，混匀） 将所得PBMC用5倍体积的1640洗涤一次 2000rpm×5min 将毛细吸管直接伸到灰白色层（在血浆和分层液间），轻轻 地吸取该层细胞（即为PBMC） 效-靶细胞作用 将效应细胞和靶细胞各0.1ml(E/T=100:1)加入96孔细胞培养板的孔中, 每份标本设2个复孔, 同时设靶细胞自然释放对照组 (0.1ml靶细胞+0.1ml RPMI-1640液) 最大释放对照组 (0.1ml靶细胞+0.1ml1％NP-40液), 1000r/min, 2min后, 置37℃、5％CO2温箱中孵育2-4h。 A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 实验组 自然释放组 最大释放组 1 2 3 4 5 6 效应细胞（100μl） + + - - - - 靶细胞（100μl） + + + + + + RPMI16