亲和沉淀——高等生物分离技术.ppt

亲和沉淀 研究进展 1、早在 1910 年就有人用不溶性淀粉选择吸附、提纯淀粉酶，这是最早的基于生物特异性进行分离纯化的实例。 2、事实上几乎所有的生物活性物质都存在类似于淀粉酶与淀粉间的亲和作用，如酶与底物、抗原与抗体、激素与受体、多糖与蛋白复合体等。这种利用生物大分子特异亲和力而设计的层析技术称为亲和层析。 3、而亲和沉淀是在亲和层析基础上建立起来。 定义 1.亲和沉淀是利用蛋白质与特定的生物合成分子（免疫配位体、基质、辅酶等）之间高度专一的相互作用而设计出来的一种特殊选择性的分离技术。是蛋白质类生物大分子相互亲和作用与沉淀分离相结合的的分离纯化技术。 2.操作过程 一次作用亲和沉淀 二次作用亲和沉淀 一次作用亲和沉淀 ①初始阶段：将水溶性化合物分子载体偶联上亲和配体，亲和配基与目标蛋白质络合形成沉淀。这与抗原-抗体的沉淀作用相似. 当配基与蛋白质的亲和结合部位的效价比为1时沉淀率最高 。 ②所得的沉淀物用一种适当的缓冲溶液进行洗涤，除去杂质； ③用一种适当的试剂将目标蛋白质从配基中解离出来。 亲和吸附介质 1、亲和吸附介质：载体+配基 2、常见载体：纤维素、琼脂糖凝胶 、葡聚糖凝胶 、聚丙烯酰胺凝胶 、多孔玻璃珠 、壳聚糖 等。 3、配基与待分离的物质之间的亲和力具有较强的特异性。 4、配基能够与载体稳定的共价结合，且不易脱落。 配基的选择 间隔臂 目标蛋白与配基亲和作用机理 亲和作用力 1.静电作用：亲合作用分子对的结构部位上带有相反电荷时，产生静电引力。 2.氢键：O…H—O或O…H—N。 3.疏水性相互作用：即两分子中均含有芳香环或烃基链等疏水基，则两者之间可发生疏水性相互作用。 4.配位键：如果两个分子均与同一金属原子配位，则两者之间可通过金属配位键间接结合。 5.弱共价键：结合力较弱的可逆共价键。如醛基和羟基之间形成的半缩醛基。 一次亲和作用的基本过程 二次作用亲和沉淀 1、利用在物理场条件（如pH值、离子强度、温度等）改变时，生物分子和介质发生可逆性沉淀的方法称为二次作用亲和沉淀。也称为场致沉淀。 2、亲和沉淀一般流程： 二次亲和沉淀一般流程 影响因素 1、离子强度 2、pH值 3、变性剂和离液离子 4、温度 5、螯合剂 6、配基密度 1、离子强度 1、若亲和作用力主要是静电作用，则提高离子强度无疑会减弱或完全破坏亲合作用。 2、若亲和作用力是氢键，则与静电作用一样。 3、若亲和作用力是疏水性相互作用，则疏水性相互作用随离子强度提高而增大。此时增大强度可提高亲和结合作用。 2、pH值 1、蛋白质为多价两性电解质，含有许多解离基团，不同的解离基团的解离常数（pKa）不同。 2、pH值可影响蛋白质的所带电荷。当静电作用对亲和结合作用的贡献最大时，pH值会严重影响亲合作用。 3、即在适当的pH值下亲合作用较高。 3、温度 1、温度升高使分子和原子的热运动加剧，结合部位的静电作用、氢键及金属配位键减弱。 2、但T升高可使疏水性相互作用增强。 4、变性剂和离液离子 1、脲和盐酸胍是蛋白质的强烈变性剂，高浓度下容易引起蛋白质变性。 2、其可抑制氢键的形成，破坏疏水性相互作用，从而减弱亲合作用。 3、另外，SCN-、I-和CIO4-等离子半径较大的离液阴离子存在下，疏水性相互作用降低。 5、螯合剂 若亲合结合作用来源于亲和分子对金属离子形成的配位键，则加入乙二胺四乙酸（EDTA）等螯合剂除去金属离子，会使亲合作用消失。 6、配基密度 1、较低时，影响吸附效率，并且吸附不彻底。 2、过高时，多点竞争吸附，也会影响吸附效率。而且对于洗脱的难度会更大。 亲和沉淀纯化技术优点 1、溶液中进行，无扩散传质阻力，亲和结合速度快； 2、亲和配基裸露在溶液中，配基利用率高； 3、离心或过滤技术回收沉淀，规模放大； 4、可用于高粘度或含微粒料液中目标产物纯化。 存在问题 1、亲和沉淀研究重点之一是亲和沉淀溶解可逆聚合物的合成。 2、迄今为止，亲和沉淀还没有在工业生产中运用的主要原因是缺乏适当的大规模亲和沉淀溶解可逆聚合物。 亲和沉淀的应用 亲和吸附介质=PLS+STI 分离纤维素酶 分离内切葡聚糖酶 提取溶菌酶 提取血清蛋白 * 汇报人：梅胜 日 期：2014-01-06 原理是双配基或多配基与含有两个以上亲和结合部位的多价蛋白质产生亲和交联，增大为较大的交联网络而沉淀。 配基：可与目标蛋白特异性结合。 1、当配基的相对分子质量较小时，将其直接固定在载体上，会由于载体的空间位阻，配基不能对生物大分子产生有效的亲和吸附作用。 2、因此，需要在配基与载体之间连接一个“间隔臂”，以增大配基与载体之间的距离，使其与生物大分子发生有效的亲和结合。 1.蛋白质参与亲合作用的机理尚不完全清楚。2.一般认为，参与亲合作用的两个