发酵工程制药（Fermentation Engineering）.pptVIP

发酵终点的确定 迟滞期 对数生长期 稳 定 期 死亡期 № 参数： 抗生素单位 过滤速度 氨基氮 菌丝形态 pH值 发酵液外观及粘度等 发酵工程（四） 基因工程菌的发酵 何为基因工程菌？宿主系统有哪些？ 基因工程菌菌发酵培养的目的和生产特点 基因工程菌生产的产品 基因工程菌：在生物体外对DNA分子进行重组，然后克隆到适合的宿主细胞进行增殖和表达，所得到的重组体菌株即为工程菌 宿主细胞-载体系统：大肠杆菌、G+细菌、酵母、哺乳动物细胞 （一）基因工程菌及宿主系统 1、大肠杆菌 如果产品翻译后不需要修饰，大肠杆菌是最普遍选用的宿主。 优点： 人们对大肠杆菌的生理学和遗传学背景了解得比其他任何生物深。有利于进行复杂的基因操作； 大肠杆菌有相当高的生长速率，并能长到高细胞浓度（50g/l）； 大肠杆菌能生长在简单的便宜的培养基上。 这些因素给大肠杆菌许多经济上的优势。但大肠杆菌不是完美的宿主。主要问题是大肠杆菌分泌(secretion)的蛋白通常在细胞内，当这些蛋白达到高浓度时，会被水解或形成不溶的包含体。其中主要是外源蛋白，但也含有其它细胞物质。包含体中的蛋白是不折叠的，不折叠的蛋白没有生物活性，必须重新溶解并使它复性。 大量的外源蛋白的产生会触发热冲击响应。热冲击调节子的一种响应是增加蛋白水解酶的活性。在一些情况下，细胞内蛋白水解酶是使蛋白的降解速率几乎等于产生的速率。 2、G+细菌 枯草杆菌是可替代大肠杆菌的菌种，它是G+菌，它没有外膜，并且能把蛋白分泌（excretion）到胞外。它的这一性质对生产非常有吸引力。然而枯草杆菌有许多问题妨碍它在商业上的采用。主要是枯草杆菌产生大量的蛋白酶，会很快降解产物。而且枯草杆菌基因构建比大肠杆菌困难，质粒稳定性也比较差，所以在使用上有较大的限制， 酿酒酵母是第一个被人利用的生物，它的最大生长速率是大肠杆菌的25%，酵母比最大的细菌大，容易从发酵液中回收。酵母有简单糖基化能力和分泌蛋白的能力。这些是它的优点。但酵母达到高表达水平比大肠杆菌困难，外源蛋白分泌到胞外也有限，现在发展了其他的酵母如甲醇营养型酵母等。 当产生是外源蛋白需要复杂的糖基化和翻译后修饰时，低等真核细胞就不能适应，要用动物细胞组织培养来达到。 3、酵母菌 4、哺乳动物细胞 哺乳动物细胞在表达时有正确的氨基酸排列，而且所有转录后处理与在整个动物中相同，在某种情况下可能转录后修饰有些不同但它可提供最接近于天然副本的产物，此外多数产物可以分泌到胞外。 但动物细胞生长缓慢，培养基价格昂贵，蛋白表达水平较低。用于重组DNA 生产蛋白的最常用的宿主是CHO（中国仓鼠卵巢细胞）。 （二）利用基因工程菌生产的特点 基因工程菌带有外源基因，外源基因可能在质粒上也可能整合到染色体上，这些基因可能不稳定。丢失外源基因的菌往往比未丢失的菌生长快得多，这样就会大大降低产物的表达。为了抑制基因丢失的菌的生长，一般在培养中加入选择压力，如抗生素。 基因工程菌的培养一般分两段。前期是菌体生长，生长到某一阶段，加入诱导因子，诱发产物表达。 三、基因不稳定性 生产的目标是得到最大量的外源蛋白，但是大量外源蛋白的形成对宿主细胞是有损害的，通常是致死的，失去制造外源蛋白的能力的细胞一般生长得快得多，从而能替代有生产能力的菌株，这就导致基因的不稳定性。 基因的不稳定性原因： 分离丢失、 结构不稳定性 宿主细胞调节突变 当细胞分裂时一个子细胞没有接受质粒就出现分离丢失 指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变 改变细胞调节，结果减少目标蛋白的合成。 （四）基因工程菌生产的产品 基因工程菌生产的主要产品有二类，蛋白质和非蛋白质。 非蛋白质产物可以通过代谢工程细胞来获得，这些细胞插入编码酶的DNA，产生新的途径或增强某一途径，从而得到新的化合物或增加产量。 现代基因工程重点在蛋白质产物上，主要产品如下： 产品最主要的用于人的治疗，此外还有用于畜牧业、食品或工业用的生物催化剂。用于注射用的治疗蛋白要求高度纯化，由于病人可能产生的强的免疫反应或副作用是灾难性的。 有的蛋白转译后还要进行修饰，如糖基化、磷酸化后才有活性。 治疗蛋白最主要的是保证产品的质量和安全，降低成本并不重要，由于这些产品大多用量很小，价格高，附加值高。 发酵工程在制药工业上的应用 抗生素发酵生产 AA发酵生产 维生素发酵生产 The end 发酵工程（三） 主要内容： 发酵过程的控制（1）中间分析项目（2）发酵过程的影响因素及分析（3）发酵终点的确定 发酵控制与中间补料视频讲座 中间分析项目 发酵过程的中间分析是生产控制的眼睛，它显