高中生物选修1_血红蛋白的提取和分离.pptVIP

血红蛋白的提取和分离 （二） 缓冲溶液： （三）电泳： 注意事项： * 2．答（1）提取蛋白质比提取DNA的难度大。这是因为，与DNA相比，蛋白质对温度、盐浓度、pH等条件要敏感得多，很容易失活；（2）并且蛋白质的空间结构多种多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的提取没有一种统一的方法，只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件，设计特定的方法。 P57练习： 复习: 1、造成蛋白质结构多样性的原因？ 2、举例说明蛋白质功能的多样性。 根据蛋白质的哪些特性，可以将不同种类的蛋白质分离开来？ 分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等。 （一） 凝胶色谱法（分配色谱法） 1、定义： 根据相对分子质量的大小分离蛋白 质的有效方法。 2.原理： 相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部通道，路程较长，移动较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动较快，从而分离。 基础知识 1、缓冲作用： 在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液PH的影响，维持溶液pH基本保持不变。 2、配制原则： （1）缓冲溶液通常由1~2种缓冲剂溶解于水中配制而成的。 （2）调节缓冲剂的使用比例可以制得在不同范围内使用的缓冲液。 弱酸和弱酸盐： H2CO3—NaHCO3 ；CH3COOH——CH3COONa 弱碱和弱碱盐：NH4OH—NH4CI 3、缓冲溶液的作用意义 生物体内的进行的各种化学反应都是在一定的PH下进行的，为了能够在实验室条件下准确模拟生物体内的过程，就必须保持体外的PH与体内的基本一致。因此缓冲溶液的正确配制和PH的准确测定，在生物化学的研究工作中有着极其重要的意义。 1、概念：是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。 2、原理：样品中各种分子带电性质、分子大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度。 3、常用的电泳方法： 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 回答问题： 1、测定蛋白质分子量通常使用哪种电泳方法？ 2、聚丙烯酰胺凝胶如何组成的？ 3、SDS是什么物质？在测定蛋白质分子量时起什么作用？ 4、用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理是什么？ 实验操作: 蛋白质提取和分离一般步骤： 1、样品处理 2、粗分离 3、纯化 4、纯度鉴定 一、样品处理： （一）基础知识： 1、血液的组成： 2、血红蛋白的结构： 血液由血浆和各种血细胞组成，其中红细胞最多。在红细胞的组成中约90%是血红蛋白。 血红蛋白由四个肽链组成，包括两个α-肽链和两个β-肽链。其中每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳。血红蛋白因含有血红素而成红色。 （二）样品处理步骤： 1.红细胞洗涤： （1）洗涤红细胞的目的是什么？ （2）如何分离红细胞？ （3）如何洗涤红细胞？ 去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。 离心→取红细胞→重复洗涤 将红细胞液体倒入烧杯，加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。 2.血红蛋白的释放： （1）如何释放血红蛋白？ （2）使用蒸馏水、甲苯有何作用？ （4）采集的血样为什么要及时并采用低速短时离心分离红细胞？ （5）为何要用生理盐水重复洗涤三次？ 洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白；用0.9%生理盐水是为了保持红细胞内外正常的渗透压，防止细胞破裂。 离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。 使红细胞破裂，释放出血红蛋白。 3.分离血红蛋白溶液： （1）如何分离血红蛋白？ 离心→分层→过滤→分液 （2）离心后分几层？每层各是什么物质？ 分4层；自上而下，第一层是无色透明的甲苯层，第二层是白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第三层是红色透明液体，是血红蛋白水溶液，第四层是其他杂质的暗红色沉淀物。 4.透析： （1）如何透析？ （2）透析袋用什么制成？作用是什么？ （3）透析目的是什么？ 透析袋一般是用硝酸纤维素（又称玻璃纸）制成的。透析袋能使小分子自由出入，而将大分子保留在袋中。 透析可以去除样品中分子量较小的杂质，或用于更换样品中的缓冲液。 血红蛋白溶液 透析袋 磷酸缓冲液 二、凝胶色谱操作： 1、凝胶色谱柱的制作： 2、凝胶色谱柱的填