临床检验免疫学 酶免疫技术.ppt

酶 免 疫 技 术 Enzyme Immunoassay 侯 珏临 床 微 免 教 研 室 目的要求 1．掌握酶联免疫吸附试验的原理、方法类型及各类型原理 2. 掌握酶免疫技术的必要试剂 3．熟悉膜载体的酶免疫测定 4．熟悉酶免疫技术的分类 5．熟悉酶免疫技术的特点 6．了解酶免疫测定的应用 标记免疫技术= 二、分类： 按检测对象分类 免疫组化技术: （immunohistochemical technique） 组织切片标本 免疫测定（immunoassay）: 液体标本 分类： 根据标记物不同 荧光免疫技术 放射免疫分析 传统三大标记技术 酶免疫技术 发光免疫技术 金免疫技术 生物素-亲和素免疫技术 酶免疫技术(Enzyme Immunoassay)  概述 酶免疫技术定义: Ag-E + Ab E-Ag Ab Ab-E + Ag Ag Ab-E 抗原抗体的免疫反应 + 酶的高效催化作用 底物 定性、定量分析 一、 技术要点： 试剂的制备 反应条件的选择 操作的标准化 必要的试剂： （1）固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂” （immunosorbent） （2）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物” （conjugate） （3）酶反应的底物 (substrate) （一）酶和底物 一）酶的适用要求： 1、催化效率高 2、制备成的酶标抗体或抗原性质稳定 3、酶催化底物产物应易于判定或测定 4、酶活性不受样品中其它成分的影响 5、酶、底物等性质稳定、价廉易得,对人体无危害 二）常用的酶： 辣根过氧化酶（ horseradish peroxidase, HRP） 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase ,AP） 其他：葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等 1、辣根过氧化酶 （ horseradish peroxidase, HRP） （1）分子结构： 主酶（糖蛋白）: 在275nm波长处有最高吸收峰 辅基（亚铁血红素）：酶活性基团 在403nm波长处有最高吸收峰 （2）HRP的底物 ： HRP催化的反应式： DH2+ H2O2 D+ H2O DH2为供氢体，H2O2为受氢体。 常用的供氢体(底物）： 邻苯二胺（O-phenylenediamine, OPD）:反应显橙黄 色，应避光，致癌性 四甲基联苯胺（3,3,5,5-tetramethylbenzidine, TMB）: 反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性，但水溶性差 ABTS (2,2-azino-di-(3- ethylbenziazobine sulfonate-6) 　①HRP催化OPD的反应： 492nm波长处有最高吸收峰 　②HRP催化TMB:无色 蓝色 黄色 在450nm波长处有最高吸收峰 ２、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase ,AP） 　 　　底物： （1） 对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP) AP催化p-NPP的反应： 405nm波长处有最高吸收峰 （2）发荧光底物：磷酸4-甲基伞酮 可用于ELISA作荧光测定 * AP灵敏性高与HRP，但不易获得纯品，稳定性及酶标记物收率 低于HRP，且价高，故应用不如HRP普及