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三氧化二砷论文：三氧化二砷对前列腺癌DU-145细胞RASSF1A基因的去甲基化作用 【中文摘要】前列腺癌(Prostate Cancer PCa)是男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,在欧美国家,其发病率在男性所有恶性肿瘤中排名第一,死亡率位居第二。我国前列腺癌发病率近年来也迅速增长,且发现时大多已处于中晚期,因此对于晚期前列腺癌的治疗是临床医师面临的巨大挑战。RASSF1A(Rasassciation domain family 1A,)属于Ras相关结构域家族,是新近发现的一个位于人染色体3p21.3上的抑癌基因,编码一组RAS效应蛋白,RASSF1A的功能分析显示该蛋白在凋亡的信号传导、微管稳定性和细胞周期循环方面均有潜在的作用,在诱导细胞凋亡及多种恶性肿瘤的发生的过程中都发挥作用。大量研究表明其在正常组织中可以表达,而在多种实体肿瘤中却出现较高频率的表达缺失,其表达缺失的机制可能有：RASSF1A基因启动子甲基化、纯合子缺失和杂合子缺失,其中以启动子甲基化为主。所以通过对其去甲基化作用可以使该基因重新表达。目前所应用的甲基化抑制剂中比较常见的是5-氮杂脱氧胞苷(5-Aza-CdR)等胞苷类似物,但是因其细胞毒性和致突变效应均较强的,故限制了它的临床应用。最近几年的大量实验研究表明三氧化二砷(As2O3)用于治疗复发和难治性的急性粒细胞白血病,缓解率高达72%以上,As2O3治疗实体瘤的疗效也处于临床研究中。这些主要是关于对As2O3的诱导细胞凋亡和细胞分化的作用的研究,而对于其去甲基化作用的研究却相对较少。本实验通过研究不同浓度的As2O3对激素非依赖性前列腺癌DU145细胞株进行药物诱导后,是否可以使其抑癌基因中的RASSF1A基因启动子区CpG岛去甲基化而诱导其重新表达,达到抑制细胞增殖的作用。从而为激素非依赖性前列腺癌的治疗提供新的治疗药物。研究三氧化二砷(As2O3)对激素非依赖性前列腺癌DU145细胞株的增殖抑制作用及对RASSF1A基因去甲基化和蛋白表达的影响,初步探索As2O3对RASSF1A基因可能的作用机制。材料与方法：1、选用激素非依赖性前列腺癌DU145细胞珠常规培养,生长至对数期时,稀释DU145细胞的浓度为4×104个/mL,再用含浓度为0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、12.0、20.0μmol/LAs2O3的1640培养基分别连续培养24、48和72 h。2、应用MTT法检测不同浓度组(0.5,1.0,2.0,4.0,6.0,12.0,20.0μ/mol/L)的As2O3不同作用时间(24,48,72 h)对激素非依赖性前列腺癌DU145细胞株增殖抑制作用,并绘制生长抑制曲线。3、应用甲基化特异性PCR(MSP)检测经不同浓度组(0、0.5、1.0、2.0、4.0μmol/L) As2O3作用激素非依赖性前列腺癌DU145细胞株72 h后,RASSF1A基因的甲基化情况。4、应用Western blot检测经不同浓度组(O、0.5、1.0×2.0、4.0/μmol/L) As2O3的作用激素非依赖性前列腺癌DU145细胞株72 h后,RASSF1A基因蛋白的重新表达情况。5、应用SPSS17.0统计软件处理实验数据,统计学差异的比较采用t检验、非参数检验及方差分析,检验水准a=0.05。结果：1、As2O3可以抑制激素非依赖性前列腺癌DU145细胞的增殖,在一定范围内随着药物浓度的增高,对前列腺癌增殖的抑制作用越明显,具有剂量依赖性(F=838.089,P0.05)。同一浓度作用时间越长,抑制率越高(F=8.849,P0.05),在浓度达到20.0μmol/L时As2O3的抑制作用最明显,具有时间依赖性。2、MSP显示在未应用As2O3处理组,激素非依赖性前列腺癌DU145细胞的RASSF1A基因呈甲基化状态,而经As2O3作用72 h后,MSP显示RASSF1A基因甲基化状态逆转。3、Western blot显示未应用As2O3处理组,激素非依赖性前列腺癌DU145细胞的RASSF1A基因蛋白表达缺失,而经As2O3作用72 h后,RASSF1A基因蛋白表达恢复。应用平均灰度值进行比较,各用药组与未用药对照组RASSF1A基因表达比较均具有显著性差异(Z=10.385,P0.001),用药组间两两比较,亦存在显著性差异(P0.05)。结论：1、As2O3对激素非依赖性前列腺癌DU145细胞株具有抑制增殖的作用,且其抑制作用随剂量的增大或时间的增长而增强,具有剂量和时间依赖性。2、As2O3可以逆转激素非依赖性前列腺癌DU145细胞株RASSF1A基因启动子CpG岛的异常甲基化情况,同时可以诱导该抑癌基因的重新表达。且随药物浓度的增大蛋白表达增强,也呈剂量依赖性。 【英文摘要