免疫学检测技术的基本原理-免疫学课件.ppt

1999\12\28 第一节 抗原或抗体的体外检测 原理：抗原抗体在体外特异性结合后，出现肉眼可见或借助仪器可检测的各种现象，据此对样品中的抗原或抗体能进行定性、定量、定位的检测。 血清学反应 ：进行抗原抗体反应时，以往多采用人或动物的血清作为抗体来源，故体外的抗原抗体反应也称血清学反应。 一、抗原-抗体反应的特点 1、抗原-抗体反应的特异性 一种抗原通常只能与其刺激机体产生的抗体结合，这种抗原-抗体结合反应的专一性称为特异性。 2、抗原-抗体反应的可逆性 非共价键结合的抗原-抗体复合物不稳定，降低溶液的pH值或提高溶液的离子强度，可使抗原-抗体复合物离解（即具可逆性）。 3、抗原-抗体反应的可见性 抗原与抗体结合后能否出现肉眼可见的反应取决于二者的比例和浓度。 4、抗原-抗体反应的阶段性 分为两个阶段，第一个是抗原-抗体特异性结合阶段，其特点是反应快，一般不能为肉眼可见；第二阶段为反应可见阶段，根据参加反应的抗原物理状态的不同，可出现凝集、沉淀和细胞溶解等现象，其特点是所需时间长，且受电解质、温度和酸碱度等因素的影响。 二、抗原-抗体反应的影响因素 1.电解质 抗原和抗体在中性和弱碱性条件下，表面带有较多的负电荷，适当浓度的电解质会使他们失去一部分负电荷而相互结合，出现肉眼可见的凝聚团块或沉淀物。抗原-抗体反应通常应用0.85%的氯化钠作为稀释液，以供给适应浓度的电解质。 2.温度 较高的温度可以增加抗原和抗体接触的机会，从而加速反应的出现。常用37℃水浴保温。 3.酸碱度 血清学反应常用pH为6-8，过高或过低的pH可使抗原抗体复合物重新离解。 三、抗原-抗体反应类型和检测方法 （一）凝集反应：颗粒性抗原（如细菌、红细胞等）与相应抗体结合，在一定条件下（电解质、pH、温度等）出现肉眼可见的凝集物，称为凝集反应。 根据抗原的性质分为直接凝集试验和间接凝集试验。 1.直接凝集试验颗粒性抗原与相应抗体直接结合并出现凝集现象的称作直接凝集试验。按操作方法可分玻片法和试管法两种。 （1）玻片法 为一种定性试验。将含有已知抗体的诊断血清与待检抗原悬液在玻片上混合，数分钟后，如出现颗粒状或絮状凝集，即为阳性反应。 此法简便快速，适用于新分细菌的鉴定或分型。如沙门氏菌的鉴定。也可用已知的诊断抗原，检测待检血清中的相应抗体，如ABO血型鉴定。 （2）试管法 为一种定量试验，用以检测血清抗体含量。以协助疾病的诊断，如肥大反应、外斐反应等 。 将待检血清用生理盐水作倍比稀释，然后加入等量抗原，置37℃水浴数小时观察。视不同凝集程度记录为++++(100％凝集)、+++(75％凝集)、++(50％凝集)、+(25％凝集)和-(不凝集)。以其++以上的血清最大稀释度为该血清的凝集价(或称滴度)。 试验时必须设置阳性血清、阴性血清和生理盐水等对照。 2.间接凝集试验(indirect agglutination)将可溶性抗原吸附于一种与免疫无关的颗粒状载体表面，与相应抗体作用，在电解质存在条件下，出现的特异性的凝集反应称为间接凝集反应。用来检测待检血清中细菌、病毒、螺旋体、寄生虫抗体及自身抗体（抗核抗体、类风湿因子等）。 优点 敏感性高，比直接凝集反应敏感2-8倍。 常用载体 用红细胞、聚苯乙烯乳胶、活性炭等颗粒作为载体，当载体吸附了可溶性抗原后即称为致敏颗粒。 间接凝集抑制试验(indirect agglutination inhibition test)：将已知Ab 先与被检的可溶性Ag混合，隔一定的时间后再加入致敏颗粒，如果已知抗体与被测抗原结合，不再出现凝集现象者称为间接凝集抑制试验。常用与妊娠诊断，即用乳胶间接凝集抑制实验检测早期妊娠妇女尿中的绒毛膜促性腺激素。 左侧对照实验：出现均匀的凝集颗粒。妊娠诊断试验阴性：出现凝集现象，即凝集未被抑制，说明待检尿液中无HCG。妊娠诊断试验阳性：不出现凝集，即凝集被抑制，说明待检尿液中有HCG。 凝集（试验阴性）不凝集（试验阳性） 反向间接凝集反应：是将已知抗体吸附到载体颗粒表面，以检测相应可溶性抗原的凝集反应。如检测乙型肝炎表面抗原（HBsAg）及甲种胎儿蛋白（AFP）协助诊断乙型肝炎和原发性肝癌。 3. 协同凝集试验(COAG) 葡萄球菌A蛋白(SPA) 能与多种动物IgG分子的Fc片结合，结合后保持其抗体活性，当与相应的抗原结合时，就可产生凝集反应。本法广泛应用于多种细菌和某些病毒的快速诊断。 （二）沉淀试验 可溶性抗原与相应的抗体结合，在一定条件下，形成肉眼可见的白色沉淀物称为沉淀反应(precipitation)。 参与沉淀试验的抗原称沉淀原，抗体称为沉淀素。抗原