STR分型技术原理.ppt

DNA 分型技术原理 基点认知技术（北京）有限公司 一、DNA分型的理论背景 DNA指纹或DNA分型是英国遗传学家Alec Jeffreys在1985年首次提出的。 STR的含义 短串联重复序列(STR)是由2—6bp重复单位构成核心序列，是一种广泛分布在人类基因组中的DNA片段，主要由核心序列拷贝数目的变化产生长度多态性。 STR是重复单位长度为2-6核苷酸的重复DNA序列 Dinucleotide (CA)(CA)(CA)(CA) Trinucleotide (GCC)(GCC)(GCC) Tetranucleotide (AATG)(AATG)(AATG) Pentanucleotide (AGAAA)(AGAAA) Hexanucleotide (AGTACA)(AGTACA) STR在人类基因组中分布广泛 HGP带来更多STR认识 目前被鉴定出的4核苷酸重复超过20，000个 整个基因组中STR数量可能超过100万！ STR占整个人类基因组序列的3％ STR的特点 特点： 1.片断短，可以复合扩增，提高识别能力。 2.多态性程度高，等位基因多，鉴别能力强。 3.适合于陈旧的样品，检测能力强。 4.灵敏度高，有利于微量样品的检测。 5.易于检测手段的自动化、标准化，重复性好。 DNA分型的步骤 二、DNA 提取 应用聚合酶链反应（PCR）技术测定临床标本中的病原体核酸成分，是一种高度敏感，且最为直接的检测手段。由于临床标本中含有蛋白质、脂类等物质，可干扰PCR反应，故在做PCR反应前必须进行核酸提取。 临床常见的标本有血清（浆）、全血、分泌物、棉拭子、脓液、体液、新鲜组织、石蜡切片等，这些临床标本的处理和保存方法各有不同。 DNA提取的方法 Chelex 方法 Chelex是一种以亚氨二乙酸为吸附因子的苯乙烯与二乙基苯的共聚物，对多价金属离子有螯合作用，可防止DNA在煮沸加热前被降解，同时在高温低离子强度下还有催化DNA释放的作用。这样既可减少DNA的损失，又可削除扩增中的一些抑制因素。 酚/氯仿法 原理： 通过酚-氯仿混合物萃取 DNA溶液 中的蛋白质类有机物质，而保留 DNA 于水相溶液中。 优点： 适用所有生物检材，提取 DNA 分子结 构完整，特别适RFLP、测序等需要大分子 DNA分析技术。 磁珠法 利用磁性硅胶吸附白细胞，用细胞裂解液裂解细胞，从细胞中游离出来的DNA分子被吸附到磁性颗粒表面，蛋白质等分子不被吸附而留在溶液中。在磁场作用下，磁性颗粒与液体分开，回收颗粒，再用纯水或TE洗脱吸附的DNA。 FTA 卡 FTA技术的核心是一种专利化合物，FTA卡片 预先被此种化合物浸透，当血液与FTA卡接触 后，细胞膜被裂解，蛋白质发生变性，DNA分子 则被捕获并与载体牢固结合，而且FTA卡片上的DNA可在室温下长时间稳定保存，FTA卡可保护其上的DNA免受核酸酶、氧化作用、紫外线、细菌和真菌的影响，生物检材中可能存在的病原体与FTA卡接触后也将失活。 保存的DNA可以方便快捷的进行纯化和洗脱。 硅胶膜法 理想DNA样品的要求 1.?? 纯度高：尽量无RNA、蛋白质、多糖、脂类的污染。 2.?? 完整性好：DNA片断比较大，无降解。 3.?? DNA浓度适当：大部分商业STR分型试剂盒的最佳 DNA浓度都在1 ng左右。 三、PCR （聚合酶链式反应） PCR技术是一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术，亦称为无细胞分子克隆技术。它是以待扩增的两条DNA链为模板，在一对人工合成的寡核苷酸引物的介导下，通过耐高温DNA聚合酶的酶促作用，快速特异地扩增出特定的DNA片断。 PCR过程示意图 荧光标记的分析方法 荧光法：亦称荧光PCR技术（fluoresence??PCR, F-PCR），是1995年由美国PE公司首先研制成功。 荧光法融汇了PCR的灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，电脑同步跟踪，数据自动化处理，直接探测PCR过程中的变化以获得定量的结果，不需要做PCR后处理或检测，完全闭管操作。 常见的PCR扩增仪 ABI公司：9700、9600、2400 Eppendorf公司：5331、5332、5333 Bio-Rad公司：MyCyc