《植物组织培养》课件第3章植物组织培养技术-灭菌方法、无菌操作技术.ppt

第三章 植物组织培养技术---灭菌方法、无菌操作技术 内容： 灭菌 无菌操作 愈伤组织的分化与再分化、脱分化 形态发生 教学目的要求 1．掌握外植体的选择条件与消毒方法； 2．掌握外植体接种操作步骤及培养的环境 条件； 3．了解愈伤组织形成的条件及愈伤组织形成过程、形态发生的调控方法，掌握愈伤组织的形态发生方式和植物组织培养中愈伤组织培养的基础技术。 4．一般掌握离体叶片和离体根培养基本过程（选修）；掌握离体茎培养的种类和操作步骤； 本节教学重点、难点： 重点：无菌操作技术；组培苗的培养 难点：无菌操作技术 第一节 外植体的选择和消毒 一、外植体的选择 选取性状优良的种质或特殊的基因型 1.选择健壮的植株 ： 健壮、无病虫 、发育正常 代谢旺盛，再生能力强，培养后比较容易成功 2.选择最适的时期 ：旺盛生长期 注意植物的生长季节和生长发育阶段：茎尖、花蕾、嫩叶 生长时间较长的块茎、鳞茎、球茎等，往往由于携菌量较多，不易消毒而难以培养成功。 3.选取适宜的大小 ：一般0.5-1cm; 脱毒0.2-0.3mm 材料太大易污染，也不需要；材料太小，易受 伤害胁迫、多形成愈伤组织， 甚至难于成活 二、灭菌与消毒 （一）有菌和无菌的范畴 有菌的范畴是：凡是暴露在空气中的物体，它的表面都是有菌的。 无菌的范畴： 经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经其他物理的或化学的灭菌方法处理后的物体。 菌类： 细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。 茵的特点： ☆极小，肉眼看不见； ☆无处不有，适应能力强； ☆繁殖力极强，条件适宜时便可大量滋生。 消毒： 指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用的过程。 （二）常用的灭菌与消毒方法 灭菌方法： 物理方法：如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常压或高压蒸煮)、射线处理(紫外线、超声波、微波)、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等灭菌措施； 化学方法：使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理，以达灭菌效果。 1.湿热灭菌（培养基） 高压灭菌的原理：在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在o．1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。 常用方法：关闭放气阀，通电后，待压力上升到O．05MPa时，关电源，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上升达到0．1MPa开始计时，压力0．1---0．15MPa，20min。 注意：1、培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。 2、完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸 气，灭菌才能彻底。 2.灼烧灭菌（用于无菌操作的器械 ） 镊子、剪子、解剖刀等： →浸入95%的酒精中 →酒精灯火焰上灼烧灭菌 →冷却后，立即使用。 3.干热灭菌（玻璃器皿及耐热用具） ——利用烘箱加热到160-180°C的温度（持续 90min）来杀死微生物。 注意： 1、干热灭菌的物品要预先洗净并干燥，工具等要妥为包扎，以免灭菌后取用时重新污染。包扎可用耐高温的塑料。 2、灭菌时应渐进升温，达到预定温度后记录时间。 3、烘箱内放置的物品的数量不宜过多，以免妨碍热对流和穿透； 4、到指定时间断电后，待充分冷凉，才能打开烘箱，以免因骤冷而使器皿破裂。 缺点：干热灭菌能源消耗太大，浪费时间。 4.过滤灭菌（不耐热的物质 ） 对象：不耐热又不能用高压灭菌处理的制剂。如：一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素等。 滤膜网孔直径：0.45μm以下，当溶液通过滤膜后，细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻。 5.紫外线和熏蒸灭菌（空间） (1)紫外线灭菌 紫外线的波长为200—300nm，其中以260nm的杀菌能力最强，要求距照射物以不超过1.2m为宜。 (2)熏蒸灭菌 使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。方法简便，空间关闭紧密即可。 常用熏蒸剂：高锰酸钾、甲醛。 常用方法：房间关闭紧密，按5—8ml／m3用量，将甲醛置于广口容器中，加5g/m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时，房间可预先喷湿以加强效果。 6.喷雾灭菌（物体表面） 70%～75%的酒精 l%-2%的来苏儿溶液 涂擦、喷雾 0.25%—1%的新洁尔灭 （桌面、墙面、双手、植物材料