组培在棉花育种上的应用及优化.doc

组培在棉花育种上的应用及优化 mmm 摘要： 1棉花组培的现状 花体细胞组织培养经过20多年的发展，在一些实验室已基本建立了陆地棉植株再生体系，但与其他作物相比，棉花体细胞胚胎发生 ,存在棉花一直被公认为是植株再生最困难的植物之一，棉花组织和细胞培养落后于其它植物。虽然棉周期长、胚发生率低、畸形苗多、生根困难等限制因子。Davidonis等报道陆地棉子叶愈伤组织在改良 Linsmaier 和Skoog培养基上继代培养 2 年后得到第一株再生植株，标志着棉花组织培养体系初步建立起来。随后，一系列的棉花体细胞胚胎发生的成功报道涌现出来 ,但在大多数获得的再生材料均含有珂字棉、岱字棉血统 ,基因型限制一直是困扰棉花体细胞培养及遗传转化广泛开展的绊脚石。近几年，棉花组织培养又获得了新的发展，Mishra等 报道了多个珂字棉品种的再生；Sakhanokho 等 首次报道了亚洲棉植株再生；Wu等利用多阶段调控手段获得了多个长江流域难再生基因型棉花品种再生植株；Sun 等利用不同浓度的激素组合、不同碳源对多个野生棉进行体细胞胚胎发生调控，获得了 5 个野生棉的再生植株，并将其用于棉花原生质体及体细胞杂交研究，使该领域的研究达到国际先进水平。尽管如此，研究的重点仍然是在体细胞胚胎的诱导方面，而对体细胞胚胎的萌发以及植株再生移栽的关注力度不够，导致棉花试管苗移栽存活率低下，最终影响到植株再生的效率。 张家明等建立了一个较易获得再生植株的技术程序和试管苗移栽的技术方法。张家明等研究发现具有胚胎发生能力的品种具有严格的地域性限制，黄河流域品种比长江流域品种容易获得再生植株。随着棉花基因工程的广泛开展，对棉花组织培养提出了更高的要求，主要表现在要求获得大量的不同 T2DNA插入位点的转基因植株，从中筛选外源基因高效表达的转化植株，避免因为多拷贝 入、位置效应、DNA 甲基化等因素导致的转基因沉默，这就要求棉花组织培养技术能够获得大量的发育正常的再生植株。目前关于棉花转基因再生植株的有效成苗技术报道尚不多。但在2007年谢德意等以棉花的胚性愈伤组织作受体材料，用农杆菌介导的遗传转化方法 ,将含有植株衰老期特异表达启动子的 ipt 基因导入4 个陆地棉品种，研究了不同基因型品种的转化效率，建立了有效的转基因再生植株成苗、移栽技术体系。 2棉花组培的方法 2.1 培养基的配置 获取无菌苗培养基：MS基本培养基：由MS大量元素、MS微量元素与B5维生素组成，蔗糖 3%，琼脂 5g/L； 顶芽生长和生根培养基：1/4 MS+IBA0.5mg/L+蔗糖3% ；1/2 MS+IBA0.5mg/L+蔗糖3% ； MS+IBA0.5mg/L+蔗糖3% ；MS+IBA0.5mg/L+蔗糖6% ；MS+IBA0.5mg/L+葡萄糖3% ，添加琼脂粉5g/L； 茎尖生长培养基：MS+IAA 0.2mg/L+KT0.2 mg/L +蔗糖3%；MS+IBA0.5mg/L+蔗糖3% MS+IBA0.5mg/L+KT0.2 mg/L+蔗糖3%；MS+IBA0.5mg/L+ KT1.0 mg/L+蔗糖6% ，添加琼脂粉5g/L； 诱导愈伤组织培养基：MS＋ 2,4 -D 0.1 mg/L＋ KT 0.1 mg/L；MS＋IAA 1.0 mg/L＋KT 0.1mg/L；MS＋IAA 2.0 mg/L＋KT 0.1 mg/L；MS＋IAA 4.0 mg/L＋KT 0.1 mg/L，添加葡萄糖3%，琼脂粉5g/L； 直接诱导胚性愈伤培养基：MS + 2,4-D 0.1 mg/L+ KT 0.1mg/L; MS + IAA1.0mg/L + KT 0.l mg/L; MS + IAA 4.0mg/L + KT 0.l mg/L；MS + IAA 4.0 mg/L+ KT 0.l mg/L，添加葡萄糖3%，琼脂5g/L； 培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整PH值至5.8。 2.2 除去棉种表面的棉絮 加入适量的(绝对不能过多)浓硫酸后,迅速均匀搅拌数分钟，见全部棉子已经变成黑色后，马上用清水冲洗，可以加点碱来中和酸性。一定要将浓硫酸彻底洗干净,否则，渗透的酸性过强也会伤害种胚。 2.3种子灭菌及接种 灭菌方法：a,去壳，70%酒精灭菌30S→30%H2O2灭菌5min;b,去壳，70%酒精灭菌30S→15%H2O2灭7min；c，70%酒精灭菌3min→30%H2O2灭菌1h→无菌水浸泡24h→去壳，将灭好的种子接种到无菌苗培养基中，封口，整理放置在光照培养箱中培养，25～28℃、光照500～2 000 lx ，每天光照16小时。 2.4.1顶芽制备 选取2～3d无菌苗[8],棉花无菌苗切去下部留下2-3厘米长度，接种在顶芽生长培养基上，在25～28℃培养、光照500～