耐热甜味蛋白brazzein的溶液NMR结构研究_二级结构和分子骨架.doc

中 国 科 学 ( C 辑) 第 29 卷 第 6 期 SCIENCE IN CHINA ( Series C) 1999 年 12 月 耐热甜味蛋白 brazzein 的溶液 NM R 结构研究 3 ———二级结构和分子骨架 戴继勋 ① 鸣 ② G?ran Hellekant ③ 王金凤 ① 王大成 3 3 高广华 丁 ( 中国科学院生物物理研究所 ,北京 100101 ; ①中国科学院生物物理研究所生物大分子国家重点实验室 ,北京 100101 ; ② Ingredient and Flavor Technology , Pepsi2Cola Company , Valhalla , NY 10595 , USA ; ③Department of Animal Health and Biomedical Sciences , University of Wisconsin2Madison , Madison , WI 53706 , USA) 摘要 brazzein 是从非洲西部野生植物 Pentadiplandra brazzeana Baillon 的果实中提 取的一种甜味蛋白. 在所有已知的甜味蛋白质中 , brazzein 的分子量最小 ,水溶性最 好 ,并且具有很好的热稳定性. 利用二维核磁共振 (2D NMR) 技术研究 brazzein 的溶 液三维结构 ,完成了包括主链和侧链在内的所有质子共振峰的序列归属. brazzein 的 二级结构包含一段α螺旋 (21～29) ,一段较短的 310 螺旋 (14～17) 和两股反平行β折 叠(34～39 , 44～50) ,分子 N 端可能形成了第 3 股β链 (5～7) . 比较研究发现 ,该甜 味分子骨架 CSαβ与蝎毒 、昆虫防卫素和植物抗菌蛋白γ2硫素的分子支架基本相同. 以此为基础 ,讨论了这种多功能分子支架的意义 ,可能的甜味活性中心及其热稳定性 的结构基础. 关键词 brazzein 甜味蛋白 核磁共振 序列归属 二级结构 一般认为 ,大分子物质 (分子量大于 2 500) 不能刺激味觉细胞产生甜味 ,因而大多数蛋白 质都是无味的. 然而目前发现了一系列能够产生甜味的蛋白质 ,它们均不含糖类 ,包括 mon2 ellin1 , thaumatin2 , pentadin , curculin3 , mabinlin4 和 brazzein5 . 普 通 甜 味 剂 如 蔗 糖 需 10 - 1～10 - 3 mol/ L 才能产生甜味 ,而甜味蛋白只需较低的浓度 ( 10 - 8 mol/ L) ,因此它们的甜味 在等摩尔时是蔗糖的数万倍. 甜味蛋白不仅可以作为低热量 、高甜度的甜味剂替代品 ,而且可 以作为甜味受体结构及其基因研究的天然工具. 1994 年从非洲西部野生植物 Pentadiplandra brazzeana Baillon 的果实中分离提纯出一种高 甜度的耐热甜味蛋白质并命名为 brazzein5 . 它是由 54 个氨基酸残基组成的单链多肽 ,含有 8 个半胱氨酸 ,形成 4 对分子内二硫键 , 其相对分子量为 6 473 , 等电点为 5 . 味觉实验表明 brazzein 的甜度是 2 %蔗糖水溶液的 2 000 倍. 与其他甜味蛋白相比 ,brazzein 的分子量最小 ,水 溶性最好 ,而且其水溶液在 80 ℃经 4 h 的热处理仍然保持甜味5 ,6 . 1998208214 收稿 ,1999202211 收修改稿 3 国家重大基础研究预选项目(952预234) 和中国科学院重点研究项目 3 3 联系人 阐明甜味蛋白质的空间三维结构将揭示甜味产生的机理和结构基础. 目前已有 2 种甜味 蛋白 monellin7 和 thaumatin8 ,9 获得了高分辨率的晶体结构 ,然而对这 2 个结构的仔细比较并 未发现明显的三维结构相似性 ,与产生甜味有关的活性区域仍然不清楚. 因为 brazzein 的分子 量最小 ,所以测定其三维结构将为揭示甜味蛋白的结构特征和确定活性作用位点提供更为直 接的证据. 材料和方法 甜味蛋白 brazzein 的纯化和表征参见文献5 ,6 , 经 C8 反相柱层析色谱鉴定样品纯度大于 90 %. 将 3 . 3 mg 蛋白样品溶于 0 . 5 mL 溶剂 ,蛋白终浓度 1 mmol/ L . 溶剂为水 (含 10 %D2O ,用 来锁场) 或重水 (纯度为 99 . 996 %) . 用稀释的盐酸或氘代盐酸调节 p H 为 3 . 5 . 样品中还含有 0 .