实验二、转座子随机突变及目标表型的筛选实验二、转座子随机突变及目标表型的筛选.pdf

现代微生物学实验技术现代微生物学实验技术现代微生物学实验技术现代微生物学实验技术 马玉超马玉超 北京林业大学生物科学与技术学院北京林业大学生物科学与技术学院 办公地点：生物楼办公地点：生物楼117117；电话：；电话：6233601662336016；； Email:myc0307@Email:myc0307@ 实实实实 验验验验 内内内内 容容容容 ♣ 染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列 ♣♣ 转座子随机突变及目的表型的筛选转座子随机突变及目的表型的筛选 ♣ 大肠杆菌β-半乳糖苷酶的诱导 ♣ 利用SDS分析融合蛋白的可溶性 ♣ 绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取 转座子随机突变及目的表型的筛选转座子随机突变及目的表型的筛选 李丽萍 实验目的实验目的 1.了解细菌常见转座子Tn5的结构及转座机理 22. 学习利用转座子进行随机插入突变的实验过程学习利用转座子进行随机插入突变的实验过程 33. 掌握双亲接合实验的原理及过程掌握双亲接合实验的原理及过程 实验原理 转座子转座子：： 转座因子或跳跃因子，它可以从遗传物质的一部分 跳跃到另跳跃到另一部分部分，从而引起遗传变异从而引起遗传变异。 转座子的发现转座子的发现：： 20世纪50年代初期，美国冷泉港实验室遗传育种学 家家McMc ClintockClintock 通过对玉米籽粒色斑不稳定现象的研通过对玉米籽粒色斑不稳定现象的研 究而发现转座现象，首次发现了能在基因组内不同 区域转移的控制成域转移的控制成分。 实验原理 细菌转座子的类型： 插入序列插入序列(Insertion(Insertion sequence);sequence); 复合转座子 (Composite transposons); Tn5 TnATnA 转座子家族转座子家族(TnA(TnA family);family); 可移动噬菌体(Mu phage). 实验原理实验原理 Tn5 ：发现于E.coli，序列全长5818bp 。 核心序列：编码三个抗生素(新霉素、博莱霉素、链霉素)； 两个倒置的IS50：IS50R编码53KD的Tnp和48KD 的转座阻遏蛋白 (Inh),两者使用同一阅读框，但启动子不同。IS50L的第1442碱基处存在一 个赭石突变，IS50具有19bp的倒置末端，两有7个碱基不相同，是转座酶 (Tnp)的作用位点。 突变位点突变位点(Mutation site) OE IE IE OE kanr strr bleor IS50L IS50R P3P3 P1 ((Tnp)p) P4 P2 (Inh) 实验原理实验原理 Tn5的转座机理 实验原理 实验原理实验原理 实验原理 非转移性质粒： 转移性质粒转移性质粒：能自动地从能自动地从一个细胞转移到另个细胞转移到另一个细胞个细胞，甚至还能甚至还能 带动供体细胞的染色体DNA向受体细胞转移; 接合作用接合作用：质粒在细菌间的转移质粒在细菌间的转移，需要供体和受体细胞间的直接需要供体和受体细胞间的直接 接触才能进行. 重组巴西